施新澤，許 琪

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

腦電圖(electroencephalogram，EEG)是通過電極將腦部自發(fā)性腦電活動隨時間變化記錄下來的圖形，在多種腦疾病的臨床診斷、療效評估和預(yù)后評價等方面發(fā)揮著重要作用[1]。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，EEG檢測廣泛應(yīng)用于癲癇動物模型的造模評價、發(fā)作監(jiān)測、癲癇藥物篩選等方面[2]。目前實驗室主要采用臨床腦功能監(jiān)護(hù)儀系統(tǒng)進(jìn)行EEG記錄，其設(shè)備昂貴且體積龐大，過高的采樣頻率生成的記錄文件也占用了大量硬盤空間。近年來，很多科學(xué)家及腦電愛好者研發(fā)了多種便攜式、可編程的生物感知平臺，如OpenBCI[3]、ThinkGear[4]等。本研究采用OpenBCI模塊驗證癲癇模型EEG活動的檢測效果，并與臨床腦功能監(jiān)護(hù)儀系統(tǒng)進(jìn)行對比，評估OpenBCI系統(tǒng)在科研領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

材料和方法

倫理聲明本研究涉及的動物實驗符合北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會的要求，操作流程遵循北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院實驗動物中心的指導(dǎo)說明進(jìn)行，并且已盡最大可能減少實驗動物的用量，減緩動物痛苦。

實驗動物和主要試劑SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠20只，8～12周齡，體質(zhì)量18～25 g，購自北京維通利華有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。海人酸 (kanic acid，KA；美國Sigma-Aldrich公司)，CMW骨水泥 (美國DuPy公司)；其他化學(xué)試劑購于國藥集團(tuán)。

癲癇動物模型建立由于癲癇動物模型造模周期較長，小鼠可能在造模期間過度發(fā)作死亡，因此在造模時需適當(dāng)增加動物用量。20只小鼠分為兩組，其中，16只小鼠構(gòu)建為KA誘導(dǎo)的慢性癲癇模型，4只小鼠作為對照組。本研究癲癇造模及EEG檢測流程見圖1A。腹腔注射5%水合氯醛將小鼠麻醉(10 ml/kg)，待小鼠呼吸平穩(wěn)后，利用腦立體定位儀固定小鼠，打開頭皮并用3%過氧化氫水溶液燒去腦膜。使用手持骨鉆開顱，通過微量注射儀向單側(cè)海馬注射300 ng溶于生理鹽水的KA(1 mg/ml)，注射坐標(biāo)為AP=-2.0 mm，ML=-1.8 mm，DV=2.3 mm。停針2 min防止注射液倒流，關(guān)顱縫合，將小鼠置于熱板上恢復(fù)。小鼠清醒后，會經(jīng)歷2～3h的癲癇持續(xù)發(fā)作狀態(tài)，滿足此標(biāo)準(zhǔn)的小鼠，約有80%會在日后逐漸發(fā)展為具有自發(fā)性癲癇發(fā)作的慢性期癲癇模型小鼠。本研究中有2只小鼠死于清醒后的癲癇發(fā)作。對照組小鼠行相同手術(shù)流程，用等量的生理鹽水代替KA。

電極植入與EEG檢測小鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)5周，期間有1只模型組小鼠癲癇過度發(fā)作死亡。剩余的小鼠腹腔注射5%水合氯醛麻醉(10 ml/kg)，利用手持骨鉆在顱骨左右各鉆1孔并植入檢測用不銹鋼電極(外徑1 mm)，正負(fù)電極分別置于注射測的海馬區(qū)域及注射對側(cè)的皮層區(qū)域。在電極與顱骨之間點入1滴502膠防止電極傾倒，并使用骨水泥進(jìn)行固定(圖1B)。經(jīng)過1周的恢復(fù)期后，2只對照組小鼠及6只模型組小鼠的電極線連接腦功能監(jiān)護(hù)儀(廣州美倫安迪電子科技有限公司)的放大設(shè)備，通過安迪特腦電圖機軟件記錄和分析結(jié)果。另外2只對照組小鼠及6只模型組小鼠的電極線連接8-bit OpenBCI腦電模塊(圖1D)，并通過OpenBCI無線接收器(圖1C)接收腦電數(shù)據(jù)，利用OpenBCI官網(wǎng)開源軟件OpenBCI GUI v3.2.0記錄癲癇發(fā)作情況，后續(xù)可通過MATLAB軟件的EEGLAB模塊進(jìn)行分析。EEG測量每天持續(xù)24 h，腦功能監(jiān)護(hù)儀和OpenBCI模塊均可同時檢測8通道的數(shù)據(jù)。根據(jù)以往的經(jīng)驗，本研究設(shè)置1～50 Hz作為腦電數(shù)據(jù)的濾波標(biāo)準(zhǔn)，并由2名經(jīng)驗豐富的實驗人員對EEG數(shù)據(jù)分析處理。

A.工作流程圖；B.小鼠電極植入與固定；C.OpenBCI無線接收器；D.OpenBCI腦電模塊

A. experimental design；B. electrode implant；C. OpenBCI USB dongle；D. OpenBCI ganglion board

圖1癲癇造模及腦電圖檢測

Fig1Kainic acid-induced mouse models of epilepsy and electroencephalographic analysis

結(jié) 果

造模結(jié)果小鼠單側(cè)海馬注射KA后，出現(xiàn)了明顯的癲癇發(fā)作，麻醉狀態(tài)下表現(xiàn)為胡須劇烈抖動，面部抽搐，清醒后發(fā)展為四肢強直性抽搐，身體背屈，跌倒翻滾等。2只小鼠由于過度抽搐而死亡。在1個月的潛伏期內(nèi)，另有1只小鼠過度發(fā)作死亡。由于臨床腦電圖機和OpenBCI模塊分別最多檢測8個通道，故在剩余的13只癲癇小鼠中隨機挑選12只，加上4只對照組小鼠后平均分為兩組，分別使用兩套系統(tǒng)進(jìn)行腦電監(jiān)測。在經(jīng)過3周的記錄后，發(fā)現(xiàn)模型小鼠中有10只達(dá)到了平均每天發(fā)作2次的水平，視為造模成功。

腦電檢測結(jié)果按使用者說明(www.openbci.com)安裝OpenBCI軟件后，將無線接收器插入USB接口，之后打開OpenBCI腦電記錄模塊上的開關(guān)，當(dāng)無線接收器上的紅色指示燈閃爍后說明腦電記錄模塊與無線接收器連接成功。打開OpenBCI軟件上的記錄程序，開始腦電記錄。連接電極進(jìn)行腦電檢測發(fā)現(xiàn)，正常小鼠的腦電波呈現(xiàn)靜息放電，波幅為20～50 μV(圖2A)，KA誘導(dǎo)的癲癇小鼠在非發(fā)作狀態(tài)下呈現(xiàn)有規(guī)律的棘波放電(圖2B)，而在發(fā)作狀態(tài)下可見爆發(fā)性的高波幅節(jié)律性間波放電，波幅200～500 μV，且在持續(xù)放電后出現(xiàn)一段明顯的抑制期(圖2C)。對比腦功能監(jiān)護(hù)儀與OpenBCI模塊的EEG記錄數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩種檢測平臺均可以良好地記錄正常小鼠的靜息腦電(圖2A、D)、KA癲癇小鼠的棘波放電(圖2B、E)及癲癇大發(fā)作放電(圖2C、F)，波形沒有明顯差異。盡管OpenBCI采樣頻率為250 Hz，低于傳統(tǒng)醫(yī)用腦電圖機5000 Hz的采樣頻率，但實際上臨床診斷一般僅需要0.3～50 Hz的濾波通即可實現(xiàn)，因此，OpenBCI模塊記錄的小鼠腦電完全能夠?qū)崿F(xiàn)對癲癇波的有效鑒別。此外，在同時記錄8個通道的腦電信號時，OpenBCI模塊表現(xiàn)良好，未發(fā)現(xiàn)明顯的通道件干擾現(xiàn)象(圖3)。

A.腦功能監(jiān)護(hù)儀記錄的靜息放電；B.棘波放電；C.癲癇大發(fā)作放電；D.OpenBCI模塊記錄的靜息放電；E.棘波放電；F.癲癇大發(fā)作放電

A.resting discharge；B.electroencephalogram spikes；C.seizure of electroencephalograph recorder；D.resting discharge；E.electroencephalogram spikes；F.seizure of OpenBCI

圖2腦功能監(jiān)護(hù)儀與OpenBCI模塊腦電圖記錄數(shù)據(jù)對比

Fig2Comparison of EEC recording data between electroencephalograph recorder and OpenBCI

討 論

EEG檢測廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床診斷，可以通過對腦電波的波幅、頻率、快慢波比例、出現(xiàn)方式等進(jìn)行分析，或是觀察陣發(fā)性高幅慢波、棘波、尖波、慢波的有無，從而判斷受試者的神經(jīng)活動狀態(tài)[6- 7]。檢測EEG常使用濕電極、干電極或者植入式電極，其中植入式電極的抗干擾能力和檢測精度最高。當(dāng)前在科研領(lǐng)域進(jìn)行腦電監(jiān)測往往還依賴著臨床診斷設(shè)備，不僅造價昂貴、體積龐大，而且針對人的采樣頻率和采樣精度會造成一定的數(shù)據(jù)冗余，浪費儲存空間。因此，本研究嘗試尋找一種更便捷的手段來采集腦電信息，以期為科研工作者提供更多選擇。

隨著多個國家“腦計劃”的啟動，越來越多計算機工程、電子工程等領(lǐng)域的學(xué)者加入了腦科學(xué)的研究，很多集硬件傳感設(shè)備、數(shù)據(jù)分析應(yīng)用、腦電算法于一體的產(chǎn)品也如雨后春筍般的出現(xiàn)。OpenBCI是一家開源的腦機接口研發(fā)公司，致力于更加低廉的、更高質(zhì)量的生物傳感元件研發(fā)，目前已有一定數(shù)量的研究采用了這些設(shè)備。國內(nèi)有學(xué)者利用微軟公司的Kinect體感設(shè)備和OpenBCI設(shè)備采集老年人的身體活動和神經(jīng)活動，并通過相關(guān)的分析設(shè)備識別具體動作或電位事件，準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上[8]。同時，更有大量學(xué)者對該平臺進(jìn)行編程和個性化，極大地滿足了個性化的科研要求[3]。而ThinkGear平臺更注重便攜性，采用干電極進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，更適用于腦電開發(fā)人員或教育領(lǐng)域[9]。

在OpenBCI模塊同時接入8對電極線進(jìn)行腦電記錄時，各通道信號記錄正常，無明顯的干擾現(xiàn)象

There was no significantly different interference phenomenon when simultaneously monitoring the 8 mice，and the recorded EEG files appeared normally

圖3利用OpenBCI模塊進(jìn)行8通道腦電同時記錄

Fig3Eight-channel EEC recording by the OpenBCI module

本研究采用OpenBCI模塊進(jìn)行EEG監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)其腦電數(shù)據(jù)采集功能與臨床腦功能監(jiān)護(hù)儀基本一致，并且該平臺設(shè)備體積較小，約為5 cm×5 cm×1 cm，質(zhì)量約15 g，可通過藍(lán)牙無線傳輸，24 h連續(xù)記錄所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量僅為500 M左右，而腦功能監(jiān)護(hù)儀的24 h數(shù)據(jù)量為6 G左右。該模塊可以使用多種供電方法，電源適配器、充電器或者干電池，其供電范圍為6～9 V。使用干電池供電能夠減少交流電的干擾，避免細(xì)微波動，信號采集的效果更好。具體到本研究，我們選擇了4節(jié)5號電池進(jìn)行6 V供電，24 h連續(xù)工作下能夠維持1周以上的時間。此外，一套8通道的OpenBCI設(shè)備成本僅2千余元，可以用于大規(guī)模的實驗?zāi)X電記錄。通過EEGLAB插件可以方便的對腦電數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、編輯、分析和轉(zhuǎn)換，同時良好的可編程能力極大地增加了其適用性。

近年來高頻腦電相關(guān)研究逐漸熱門，而OpenBCI模塊的采樣頻率為250 Hz，無法采集到更高頻的腦電信號，因此這部分的研究還無法依賴OpenBCI模塊，希望相關(guān)的研發(fā)人員能進(jìn)一步提高該模塊的采樣頻率。但如果只使用該模塊記錄實驗動物的癲癇發(fā)作狀態(tài)與頻率，還是綽綽有余。以本課題組的癲癇研究為例，一個理想的腦電檢測平臺應(yīng)該具備以下特點：(1)能夠有效地檢出靜息放電、棘波放電、癲癇大發(fā)作放電等發(fā)作狀態(tài)；(2)可以長期連續(xù)監(jiān)測無故障；(3)能夠同時監(jiān)測大批量動物；(4)盡可能低的設(shè)備成本和儲存空間成本。綜上，本研究結(jié)果顯示，OpenBCI腦電平臺可以較好地完成腦電記錄和分析工作，有進(jìn)一步優(yōu)化和推廣的價值。