王興 ，白明輝 ，季佳 ，鄒艷紅 ，楊菲 ，鄧?yán)盍?，范琳博，劉瑤，邱迪，劉秋紅

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 兒科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 口腔科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，黑龍江 佳木斯 154002）

霉酚酸酯（mycophenolatemofeitil, MMF）是臨床上治療腎病綜合征（nephrotic syndrome, NS）的常用藥物[1-3]。大量研究證實(shí)，足細(xì)胞不可逆損傷是NS患者出現(xiàn)蛋白尿的主要機(jī)制之一，因此修復(fù)和保護(hù)足細(xì)胞是阻止腎功能惡化的主要策略[4]。microRNAs（miRNAs）在多種腎疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[5]。尋找MMF靶向調(diào)控的miRNAs分子對(duì)明確MMF的作用機(jī)制具有重要臨床意義。筆者首先采用基因芯片技術(shù)，篩選與NS密切相關(guān)的miRNAs作為候選標(biāo)志物，并通過(guò)探討MMF對(duì)阿霉素腎?。╝driamycin nephropathy, ADN）大鼠模型足細(xì)胞的保護(hù)作用，以及對(duì)腎組織miRNAs的影響，闡明MMF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只6～8周齡成年健康SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0003。體重180～220 g，平均（192.46±6.13）g。將大鼠分籠飼養(yǎng)，3或4只/籠，喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料及消毒的自來(lái)水，自由活動(dòng)與進(jìn)食、進(jìn)水，保證動(dòng)物房?jī)?nèi)安靜、清潔、通風(fēng)，溫度控制在（22±1）℃。

1.2 受試藥物與主要試劑

注射用鹽酸多柔比星（阿霉素）（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），MMF（上海羅氏制藥有限公司），PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，miRelute miRNA 提取分離試劑盒、RT Reagent Kit、cDNA合成試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反 應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒、TUNEL染色試劑盒購(gòu)自北京天根科技生化有限公司，Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），DEPC（美國(guó)Sigma公司），兔抗鼠Nephrin單克隆抗體、ZO-1兔抗鼠多克隆抗體、Podoplanin兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

Eppendorf 5427 R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、各種型號(hào)的移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，CFX-96-C1000 qRT-PCR 儀、miRNA PCR Array Data Analysis Software、iMake多功能酶標(biāo)儀、SDS-PAGE電泳儀及電轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司，CX41倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），AUW120電子分析天平（日本島津公司），Amersham電泳儀（瑞典Bioscience公司），LAS-4000 min凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)（日本FUJIFILM公司）。

1.4 動(dòng)物模型的復(fù)制與分組

經(jīng)過(guò)為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，稱(chēng)量并記錄大鼠體重，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（CTL組）、ADN模型組（ADN組）和MMF干預(yù)組（MMF組），每組20只。ADN組和MMF組大鼠都屬于ADN模型，筆者按照參考文獻(xiàn)[6]的方法，一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg阿霉素溶液（0.2%）復(fù)制ADN模型；而CTL組大鼠以同樣的方式注射生理鹽水作為對(duì)照。1周后收集大鼠24 h尿液，測(cè)定24 h 尿蛋白量，尿蛋白 ＞30 mg/24 h 則表示模型復(fù)制成功。最終，ADN組和MMF組分別有18和19只大鼠模型復(fù)制成功，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 藥物干預(yù)

每日觀察受試大鼠進(jìn)食、排便、活動(dòng)、精神狀況等，稱(chēng)重1次/d。根據(jù)動(dòng)物體重計(jì)算當(dāng)日給藥量。CTL組和ADN組：每天灌胃無(wú)菌生理鹽水，1 ml/100 g，1 次 /d，連續(xù)給藥 28 d。MMF 組：每天灌胃 1% MMF 溶液，20 mg/kg，1 次 /d，連續(xù)給藥 28 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 腎功能 給藥第 0、7、14、21 和 28 天時(shí)，用代謝籠采集大鼠24 h尿液，檢測(cè)尿蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，經(jīng)尾靜脈采集外周血3 ml，置于枸櫞酸鈉真空采集管中，檢測(cè)各組大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血清肌酐（serum creatinine, Scr）水平。

1.6.2 腎組織病理學(xué)檢查 待實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將大鼠頸椎脫臼處死，取出腎組織，用10%甲醛固定，包埋成蠟塊。脫蠟水化后，用石蠟切片機(jī)切片，厚約2μm，置于載玻片上。烘干48 h后，進(jìn)行HE、PAS或Masson染色，觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.6.3 大鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況 按照 TUNEL 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，置于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況。

1.6.4 大鼠腎組織 miRNAs芯片分析 取大鼠腎組織提取總RNA：取100 mg組織樣本置于EP管中，加入MZ裂解液，按照miRelute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作；采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。測(cè)定濃度和純度后進(jìn)行miRNAs芯片分析，后續(xù)操作委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?。

1.6.5 腎組織 miRNAs ①提取腎組織總 RNA：實(shí)驗(yàn)方法同1.6.4。②RNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃?zhèn)溆?。③qRT-PCR：按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以組織cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，將20μl反應(yīng)體系置于 37℃恒溫水浴 60 min，85℃、5 s，加入去離子水至100μl，各反應(yīng)孔取2μl進(jìn)行PCR。冰浴中配制 20μl PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火 30 s，共 45 個(gè)循環(huán)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR結(jié)果判斷：根據(jù)使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析miRNAs與尿蛋白的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及體重變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CTL組大鼠飲食和活動(dòng)正常；ADN組大鼠出現(xiàn)食欲減退、水腫、脫毛等情況，甚至有2只大鼠出現(xiàn)明顯的腹水；與CTL組大鼠相比，MMF組大鼠雖然也存在食欲減退、生長(zhǎng)遲緩的情況，但是較ADN組大鼠輕。比較3組大鼠給藥后0、7、14、21和28 d的體重變化，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=243.451，P=0.000）；②3組大鼠體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.752，P=0.000）；③ 3組大鼠體重變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.594，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，自給藥7 d起，ADN組和MMF組大鼠體重低于CTL組大鼠（P＜0.05）；同時(shí)MMF組大鼠平均體重高于AND組（P＜0.05）。見(jiàn)表 1 和圖 1。

2.2 各組大鼠尿蛋白的變化

3組大鼠尿蛋白含量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)尿蛋白含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=735.62，P=0.000）；② 3組大鼠尿蛋白含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.769，P=0.000）；③3組大鼠的尿蛋白含量變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.678，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，給藥當(dāng)天，ADN組和MMF組大鼠尿蛋白含量高于CTL組（P＜0.05）；ADN組和MMF組大鼠尿蛋白含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但是自給藥7 d后，雖然MMF組大鼠尿蛋白含量仍然高于CTL組，但是低于ADN組（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體重比較 （g，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體重比較 （g，±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n 給藥后0 d 給藥后7 d 給藥后14 d 給藥后21 d 給藥后28 d CTL 組 20 224.01±5.21 237.30±8.16 250.30±9.40 265.61±9.17 285.05±12.81 ADN組 18 210.39±6.23 219.00±10.461） 228.67±15.491） 234.06±23.291） 237.78±28.851）MMF 組 19 212.42±6.61 223.42±10.251）2） 234.37±12.251）2） 245.21±18.081）2） 263.32±22.341）2）

圖1 各組大鼠體重變化趨勢(shì) （±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的尿蛋白比較 （mg/24 h，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的尿蛋白比較 （mg/24 h，±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n 給藥后0 d 給藥后7 d 給藥后14 d 給藥后21 d 給藥后28 d CTL 組 20 18.85±5.69 19.47±5.22 17.13±6.91 17.45±7.47 18.26±6.29 ADN 組 18 40.13±11.081） 95.87±23.711） 142.39±45.461） 229.35±76.151） 240.11±106.021）MMF 組 19 40.72±9.341） 51.56±16.421）2） 58.96±15.651）2） 61.71±16.231）2） 60.78±19.871）2）

圖2 各組大鼠尿蛋白變化趨勢(shì) （±s）

2.3 各組大鼠生化指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3組大鼠外周血BUN和Scr水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，ADN組、MMF組大鼠血清BUN和Scr含量高于CTL組（P＜0.05）；與ADN組比較，MMF組大鼠血清BUN和Scr含量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠生化指標(biāo)比較 （±s）

表3 各組大鼠生化指標(biāo)比較 （±s）

注：1）與CTL 組比較，P＜0.05；2）與ADN組比較，P＜0.05

組別 n BUN/（mmol/L） Scr/（μmol/L）CTL組 20 7.59±0.74 29.75±2.56 ADN組 18 18.12±0.831） 62.53±2.981）MMF 組 19 14.65±0.791）2） 38.27±2.611）2）F值 894.48 732.59 P值 0.000 0.000

2.4 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化

光鏡下觀察CTL組大鼠腎小球形態(tài)基本正常，未見(jiàn)系膜增生，上皮細(xì)胞足突清晰可見(jiàn)；而ADN組大鼠腎小球肥大，系膜細(xì)胞增生，上皮細(xì)胞足突廣泛融合，毛細(xì)管腔狹窄，間質(zhì)出現(xiàn)輕、中度纖維化；MMF組大鼠腎小球變化較ADN組輕，但是與CTL組比較，仍可見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖3。

2.5 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL熒光染色定位于細(xì)胞核。CTL組、ADN組、MMF組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率分別為（3.56±1.32）%、（31.75±6.44）%和（14.73±5.18）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=172.608，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，ADN組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率高于CTL組（P＜0.05）；MMF組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率雖然高于CTL組（P＜0.05），但是低于ADN組（P＜0.05）。見(jiàn)圖 4、5。

2.6 各組大鼠腎組織miRNAs芯片分析結(jié)果

采用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描結(jié)果，提取探針信號(hào)值，將相同的探針值中值合并，對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)的miRNAs（Fold＞1.5且P＜0.05）。各組芯片之間信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)性分析：CTL組與ADN組的相關(guān)系數(shù)為0.715，ADN組與MMF組的相關(guān)系數(shù)為0.632，CTL組與MMF組的相關(guān)系數(shù)為0.979。與CTL組相比，ADN組主要有19個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，23個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。與ADN組相比，MMF組主要有7個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，8個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。其中，相較于CTL組，ADN組大鼠腎組織中rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達(dá)上調(diào)，rnomiR-24、rno-miR-300-3c表達(dá)下調(diào)，而與ADN組相比，MMF組大鼠腎組織中rno-miR-24、rno-miR-300-3c表達(dá)上調(diào)，rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖6。

圖3 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化

圖4 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×400）

圖5 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

2.7 各組大鼠腎組織miRNAs含量比較

3組大鼠腎組織rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24、rno-miR-300-3c表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與CTL組相比，ADN組大鼠腎組織rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）， 而 rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c下調(diào)（P＜0.05）；與ADN組相比，MMF組大鼠腎組織rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），rno-miR-23a和rno-miR-300-3p下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

圖6 層次聚類(lèi)圖

2.8 大鼠腎組織miRNAs與尿蛋白的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，rno-miR-23a、rno-miR-300-3p與尿蛋白呈正相關(guān)（r=0.773和0.695，均P=0.000）；而rno-miR-24、rno-miR-300-3c與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.664 和 -0.647，均P=0.000）。

表4 各組大鼠腎組織miRNAs表達(dá)水平比較 （±s）

表4 各組大鼠腎組織miRNAs表達(dá)水平比較 （±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n rno-miR-23a rno-miR-300-3p rno-miR-24 rno-miR-300-3c CTL 組 20 1.00±0.07 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.03 ADN組 18 2.89±0.121） 2.71±0.041） 0.61±0.021） 0.54±0.041）MMF 組 19 1.23±0.081）2） 1.47±0.041）2） 0.86±0.041）2） 0.95±0.051）2）F值 2350.62 10772.77 1832.87 714.06 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著人們飲食習(xí)慣的改變，加之環(huán)境因素的影響和生活工作壓力的增大，我國(guó)慢性腎病患者人群呈逐年增加的趨勢(shì)，成為威脅人類(lèi)健康的主要原因之一[7]。目前普遍認(rèn)為，足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病患者主要的發(fā)病機(jī)制之一[8]。足細(xì)胞是位于腎小球基底膜外側(cè)的最后一道濾過(guò)屏障，足細(xì)胞損傷導(dǎo)致腎小球基底膜通透性增加，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，從而形成蛋白尿[9]。蛋白尿是絕大多數(shù)腎臟疾病早期出現(xiàn)的最常見(jiàn)的臨床癥狀[10]。目前大多數(shù)關(guān)于NS發(fā)病機(jī)制的研究都是集中在足細(xì)胞特異性表達(dá)分子上，如Nephrin、ZO-1、Podoplanin等，尤其是Nephrin蛋白表達(dá)下調(diào)與足細(xì)胞損傷關(guān)系最為密切[11]，但是關(guān)于Nephrin蛋白的調(diào)控機(jī)制仍未明確。近幾年，隨著基因組學(xué)研究的深入及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始重視miRNAs在各種疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。

miRNAs是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中僅具有22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的內(nèi)源性小分子物質(zhì)，與人體內(nèi)1/3基因的表達(dá)密切相關(guān)，因具有特異性、高度保守性、集簇性等特點(diǎn)，成為多種疾病研究的新靶點(diǎn)[12]。同樣，也有大量miRNAs高表達(dá)于腎組織細(xì)胞，在腎臟發(fā)育和腎功能調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。既往研究顯示，miR-200家族、miR-300家族、miR-23家族、miR-26家族都與腎組織纖維化密切相關(guān)[14]。因此，探討miRNAs與足細(xì)胞損傷的關(guān)系對(duì)于NS發(fā)病機(jī)制的研究及新藥研發(fā)具有十分重要的臨床價(jià)值。

目前，糖皮質(zhì)激素一直是NS患者的首選藥物，但是對(duì)于反復(fù)發(fā)作、激素依賴(lài)性/耐藥性NS患者，臨床建議選擇免疫抑制劑治療[15]。上個(gè)世紀(jì)末才開(kāi)始將MMF用于激素抵抗性或復(fù)發(fā)性NS的治療[16]。雖然降低蛋白尿的臨床療效已經(jīng)得到普遍認(rèn)可，但是其作用機(jī)制仍尚未明確。ADN大鼠是公認(rèn)的、使用最為普遍的腎臟微小病變動(dòng)物模型，關(guān)于模型復(fù)制方法，目前沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)認(rèn)為一次性注射大劑量阿霉素（≥7.5 mg/kg），雖然模型復(fù)制快，病變顯著，但是易出現(xiàn)嘔吐等副作用，大鼠死亡率較高[17]。而有文獻(xiàn)建議多次注射小劑量阿霉素（≤5 mg/kg），雖然癥狀適中，模型復(fù)制成功率較高，但是癥狀出現(xiàn)緩慢，模型復(fù)制周期長(zhǎng)[18]。因此，筆者基于多年實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選擇一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg，大鼠生理狀況良好，死亡率低，癥狀適中。根據(jù)HE、PAS、Masson染色結(jié)果顯示，模型大鼠具備典型的急性足細(xì)胞損傷的特征，不僅出現(xiàn)蛋白尿，而且可觀察到腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞足突廣泛融合、毛細(xì)管腔狹窄、間質(zhì)出現(xiàn)輕、中度纖維化等足細(xì)胞損傷特征。同時(shí)筆者采用TUNEL染色法，證實(shí)模型大鼠足細(xì)胞凋亡率明顯升高。但是經(jīng)MMF作用28 d后，上述腎組織損傷、蛋白尿癥狀及足細(xì)胞凋亡情況都得到顯著改善。為進(jìn)一步證實(shí)MMF對(duì)足細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制，筆者采用基因芯片技術(shù)篩查差異性表達(dá)的miRNAs，結(jié)果顯示，與CTL組相比，ADN組有19個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，23個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。并且層次聚類(lèi)圖顯示，miRNAs具有集簇分布的特點(diǎn)。另外，與ADN組相比，MMF組主要有7個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，有8個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。這其中都包括rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c。rno-miR-23a和rno-miR-24位于19號(hào)染色體[19]，而miR-300-3p和miR-300-3c位于6號(hào)染色體[20]，因此筆者推測(cè)，19號(hào)和6號(hào)染色體的基因可能與NS發(fā)病密切相關(guān)，而且彼此在調(diào)控生物學(xué)行為過(guò)程中可能具有協(xié)同作用。為證實(shí)上述結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采取qRP-PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和 rno-miR-300-3c的表達(dá)差異，結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。并且rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c表達(dá)水平都與尿蛋白密切相關(guān)。以往，關(guān)于miR-23a/24/300-3p/300-3c的研究證實(shí)，這幾種基因都屬于靶向炎癥因子的重要基因，除與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)外，還參與細(xì)胞的分化、增殖等生物學(xué)行為。但是尚沒(méi)有研究關(guān)注其與足細(xì)胞損傷的關(guān)系。筆者只是初步探討miR-23a/24/300-3p/300-3c可能參與蛋白尿的生成和足細(xì)胞損傷過(guò)程，為MMF作用機(jī)制的研究提供新思路，并且為進(jìn)一步藥物研究提供潛在的靶點(diǎn)基因，但是還需要后續(xù)研究探討具體對(duì)下游蛋白分子或信號(hào)通路的影響。

綜上所述，通過(guò)復(fù)制ADN大鼠模型，筆者證實(shí)MMF具有抑制足細(xì)胞損傷和蛋白尿生成的作用，其機(jī)制可能是對(duì)19號(hào)和6號(hào)染色體部分miRNAs有干預(yù)作用。但是本項(xiàng)研究只是初步分析MMF對(duì)某些重要miRNAs的影響，為NS發(fā)病機(jī)制的研究及潛在治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供理論證據(jù)，仍然需要進(jìn)一步研究證實(shí)miRNAs對(duì)其相應(yīng)信號(hào)通路及蛋白的調(diào)控作用。