曹啟旺，徐慧巧

（湖南省人民醫(yī)院 疼痛科，湖南 長沙 410005）

三叉神經(jīng)痛是一種臨床較常見的神經(jīng)病理性疼痛，主要特點(diǎn)是患側(cè)三叉神經(jīng)支配區(qū)域出現(xiàn)可觸誘發(fā)性或自發(fā)性的劇烈疼痛。有研究表明，外源性內(nèi)皮素-1（Endothelin-1, ET-1）可以誘發(fā)動物形成短暫且劇烈的痛覺過敏、自發(fā)痛等疼痛反應(yīng)[1-6]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大鼠眶下神經(jīng)干注射ET-1，力求復(fù)制一種與人類三叉神經(jīng)痛相接近的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 采用健康清潔級成年雄性SD 大鼠，體重250～300 g，購自長沙天勤生物公司[動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011]，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要設(shè)備與試劑 Von Frey 測痛儀（天津儀數(shù)科技），ET-1（美國Sigma公司）溶解在去離子蒸餾水中[7]，卡馬西平片（100 mg/片，上海三維制藥）溶解在生理鹽水中。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復(fù)制 健康 SD 大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，稱重后用10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔注射麻醉，取右側(cè)臥位，固定頭部及四肢。右側(cè)頰部顴骨下緣前1/3段脫毛、消毒、鋪巾。取1 cm長切口，將皮下組織向觸須墊方向鈍性分離，在顯微鏡下找到眶下孔并分離出眶下神經(jīng)，將針頭插入眶下神經(jīng)干的鞘膜內(nèi)，用無菌紗條將周圍組織與眶下神經(jīng)隔離，然后注入不同劑量的ET-1溶液或生理鹽水，術(shù)后縫合切口[8-9]。將術(shù)后5 min內(nèi)蘇醒的大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn) 1：將 24 只 SD 大鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組8只。A、B組分別經(jīng)眶下神經(jīng)注射8和16 nmol ET-1溶液，C組注射10μl生理鹽水。觀察各組大鼠給藥后60 min眶下神經(jīng)支配區(qū)域機(jī)械痛閾值和抓臉行為的變化。②實(shí)驗(yàn)2：將16只SD大鼠隨機(jī)分為D、E組，每組8只。D、E組分別喂卡馬西平 10 mg/（kg·d）、生理鹽水，連續(xù) 3 d。然后按實(shí)驗(yàn)1的方法復(fù)制三叉神經(jīng)痛模型，觀察注射ET-1后60 min大鼠眶下神經(jīng)支配區(qū)域機(jī)械痛閾的變化。

1.3 大鼠行為學(xué)檢測

大鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3 d，術(shù)前10 min，以及術(shù)后10、20、30、40、50和60 min分別進(jìn)行行為學(xué)測定。采用Von Frey細(xì)絲測定大鼠右側(cè)觸須墊機(jī)械刺激閾值，刺激強(qiáng)度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 g。大鼠出現(xiàn)≥1項(xiàng)表現(xiàn)即判定為陽性反應(yīng)：①將頭面部藏在身下以免受刺激的退縮反應(yīng)；②連續(xù)≥3次搔抓面部刺激區(qū)域的抓臉行為；③抓咬刺激物并有攻擊動作[10]。由4.0 g開始刺激，如有反應(yīng)，則用低一級刺激力度的細(xì)絲；如沒有反應(yīng)，則加大一級刺激力度的細(xì)絲。以此類推，從有反應(yīng)開始再給3次相同強(qiáng)度的刺激。如用大鼠對最大力度12.0 g的刺激無反應(yīng)，則痛覺閾值為12.0 g。記錄大鼠術(shù)后60 min自發(fā)性抓臉行為的次數(shù)（除外細(xì)絲刺激誘發(fā)的抓臉行為）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A、B、C組大鼠術(shù)后機(jī)械痛閾值和抓臉行為的變化

A、B、C組大鼠右側(cè)觸須墊部術(shù)后10、20、30、40、50和60 min的機(jī)械痛閾值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①術(shù)后不同時間點(diǎn)大鼠右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值有差別（F=129.455，P=0.000）；②3組大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值有差別（F=41.630，P=0.000），B組較A、C組低，相對痛覺反應(yīng)敏感性高；③3組大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值變化趨勢有差異（F=34.711，P=0.000）（見表1和圖1）。A、B、C組大鼠術(shù)后抓臉行為分別為（4.875±0.835）、（8.000±0.756）和（2.625±1.061）次，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.127，P=0.000），B組高于A、C組，相對自發(fā)性疼痛反應(yīng)次數(shù)多（P＜0.05）。經(jīng)眶下神經(jīng)注射 16 nmol ET-1 更容易引起大鼠產(chǎn)生三叉神經(jīng)痛樣痛覺過敏和自發(fā)性疼痛反應(yīng)。

2.2 D、E組大鼠術(shù)后機(jī)械痛閾值和抓臉行為的變化

D、E組大鼠右側(cè)觸須墊部術(shù)后10、20、30、40、50和60 min的機(jī)械痛閾值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①術(shù)后不同時間點(diǎn)大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值有差別（F=105.367，P=0.000）；②兩組大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值有差別（F=32.870，P=0.000），D 組較 E 組高，相對痛覺反應(yīng)敏感性低；③兩組大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部的機(jī)械痛閾值變化趨勢有差別（F=37.249，P=0.000）?？R西平可較好地抑制三叉神經(jīng)痛大鼠模型最主要的疼痛行為學(xué)改變。見表2和圖2。

表1 3組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)機(jī)械痛閾值比較 （n =8，g，±s）

表1 3組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)機(jī)械痛閾值比較 （n =8，g，±s）

組別 10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min A 組 8.50±1.41 7.25±2.12 6.25±1.28 6.50±0.93 7.50±1.41 8.00±1.51 B組 6.50±1.77 5.25±1.83 2.25±1.17 3.00±1.51 4.00±1.51 6.50±1.41 C 組 11.00±1.07 10.75±1.04 10.50±0.93 11.00±1.07 10.75±1.04 11.00±1.07

圖1 3組大鼠術(shù)后機(jī)械痛閾值的變化趨勢

表2 D、E組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)機(jī)械痛閾值比較 （n =8，±s）

表2 D、E組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)機(jī)械痛閾值比較 （n =8，±s）

組別 10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min D組 9.50±1.41 8.75±1.49 8.25±1.67 9.00±1.51 9.25±1.83 10.00±1.51 E組 6.50±1.77 5.25±1.83 2.25±1.17 3.00±1.51 4.00±1.51 6.50±1.41

圖2 D、E組大鼠術(shù)后機(jī)械痛閾值的變化趨勢

3 討論

三叉神經(jīng)痛患者的患側(cè)三叉神經(jīng)支配區(qū)域可出現(xiàn)痛覺過敏、自發(fā)痛和觸誘發(fā)痛等典型神經(jīng)病理性疼痛癥狀，痛覺過敏和觸誘發(fā)痛可因機(jī)械或化學(xué)刺激而誘發(fā)，自發(fā)痛則表現(xiàn)為疼痛區(qū)域可自發(fā)出現(xiàn)陣發(fā)性劇痛。臨床上，三叉神經(jīng)痛多因某種誘因作用于三叉神經(jīng)感覺通路上某一部位而引起。ET-1是一種含有21個氨基酸的強(qiáng)效血管活性肽，作用于外周傷害性感受器的內(nèi)皮素A受體可引起神經(jīng)性疼痛痛覺過敏與自發(fā)痛[11-13]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大鼠眶下神經(jīng)干注射16 nmol ET-1后60 min，大鼠眶下神經(jīng)支配區(qū)域出現(xiàn)機(jī)械痛閾值降低（痛覺過敏）和自發(fā)性的抓臉行為次數(shù)增多（自發(fā)痛），筆者推測可能是ET-1使眶下神經(jīng)感覺神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度升高和鈉通道電流增強(qiáng)[14-15]，增加神經(jīng)元細(xì)胞動作電位產(chǎn)生的頻率，使神經(jīng)元過度興奮，產(chǎn)生痛覺過敏和自發(fā)痛等典型三叉神經(jīng)痛行為學(xué)表現(xiàn)。

卡馬西平是臨床上治療三叉神經(jīng)痛的首選藥物，能降低神經(jīng)細(xì)胞膜對鈉離子和鈣離子的通透性，從而降低神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，延長不應(yīng)期，抑制神經(jīng)元的過度興奮，提高患者的痛閾，降低疼痛強(qiáng)度及發(fā)作頻率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卡馬西平喂藥大鼠術(shù)后右側(cè)觸須墊部對機(jī)械刺激的痛敏反應(yīng)敏感性較對照組降低，說明卡馬西平可抑制模型大鼠的觸誘發(fā)痛和自發(fā)痛等典型三叉神經(jīng)疼痛行為學(xué)改變，從另一個角度證明經(jīng)大鼠眶下神注射ET-1復(fù)制三叉神經(jīng)痛模型的可行性。

綜上所述，經(jīng)眶下神注射ET-1復(fù)制三叉神經(jīng)痛模型是與臨床三叉神經(jīng)痛較接近的動物模型之一，但本模型也存在一定的局限性和不足。首先，本模型更趨向于炎癥刺激所引起的三叉神經(jīng)痛；其次，本模型持續(xù)時間太短。相信隨著醫(yī)學(xué)工作者對三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的深入和實(shí)驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)，這些缺點(diǎn)都可以克服。