朱坤，徐楠楠，韓振東，白學(xué)義

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 心胸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，2015年我國食管癌新發(fā)47.79萬例，死亡37.50萬例，分別居全部惡性腫瘤的第3和4位，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]。食管癌早期癥狀隱匿、進(jìn)展迅速且侵襲性強(qiáng)，多數(shù)患者確診時已處于晚期，導(dǎo)致患者總體生存率僅為20%左右[2]。因此，明確影響食管癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制對食管癌的早期診斷及靶向藥物開發(fā)具有重要意義。近年來發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA H19（LncRNA H19）參與多種惡性腫瘤的進(jìn)展[3]。本研究通過體外實驗探究LncRNA H19在食管癌中的表達(dá)情況及其與食管癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為尋找食管癌臨床診治的新靶標(biāo)提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月—2017年3月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心胸外科收治的72例食管癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織（距離原發(fā)灶＞5 cm），取材后用液氮保存并標(biāo)記?；颊呔鶠槌醢l(fā)食管癌，術(shù)前未行放化療、免疫治療等抗腫瘤治療。其中，男性41例，女性31例；年齡33～75歲，平均（54.9±13.1）歲；高、中分化48例，低分化24例；TNM分期Ⅰ期13例，Ⅱ期36例，Ⅲ期23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。本研究中患者均簽署知情同意書。

1.2 人食管癌細(xì)胞TE1的培養(yǎng)及細(xì)胞系構(gòu)建

人食管癌細(xì)胞TE1（美國ATCC公司）用RPMI-1640（美國Gibco公司）+10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國Gibco公司）培養(yǎng)。人腎上皮細(xì)胞系HEK293T（美國ATCC公司）是一種工具細(xì)胞，使用DMEM（美國Gibco公司）+10%FBS培養(yǎng)，于ACB-6A1超凈工作臺（新加坡Esco公司）中嚴(yán)格無菌操作，37℃、5%二氧化碳CO2常規(guī)3111生化培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)。TE1細(xì)胞在其中進(jìn)行慢病毒的包裝后收集病毒懸液。利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國Thermo公司）轉(zhuǎn)染表達(dá)LncRNA H19的慢病毒載體及空白載體（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）人食管癌細(xì)胞TE1中[4]。收集含LncRNA H19慢病毒載體和空白載體的病毒懸液。實驗組采用 RPMI-1640+10% FBS 與含 LncRNA H19慢病毒載體的懸液1∶1混合培養(yǎng)3 d；對照組采用RPMI-1640+10% FBS與含空白載體的懸液1∶1混合培養(yǎng)3 d，期間加入2μl聚凝胺（美國Sigma公司），1μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞（美國Sigma公司）至細(xì)胞穩(wěn)定生長。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

從液氮中取出組織標(biāo)本，取適量組織進(jìn)行研磨，1 ml RNAiso Plus（日本 TaKaRa 公司）重懸組織 ；收集兩組6 cm培養(yǎng)皿中融合度＞80%的對數(shù)生長期細(xì)胞，同樣1ml RNAiso Plus重懸細(xì)胞。將準(zhǔn)備好的組織或細(xì)胞樣本用Trizol法抽提總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）將2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，稀釋引物至 100 nmol/ml，LncRNA H19 正向引物：5’-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3’；反向引物：5’-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3’；β-actin 正向引物：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’；反向引物：5’-GCTGATCCACATCTGCT-3’。 與 Sybr Green 熒光染料（日本TaKaRa公司）配置，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 系 統(tǒng)（Applied Biosystems 7500）進(jìn)行熒光定量分析，β-actin作為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算各個樣本LncRNA H19的相對表達(dá)量，設(shè)置3個重復(fù)孔，計算其均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 Transwell侵襲及遷移模型

將50μg/ml基質(zhì)膠（美國Corning公司）與RPMI-1640培養(yǎng)基1∶8混合，均勻平鋪至Transwell小室（美國Corning公司），于生化培養(yǎng)箱中孵育4 h，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸兩組細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)儀（美國Bio-Rad公司）檢測細(xì)胞懸液濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml，取100μl加至鋪基質(zhì)膠的Transwell小室中央，同樣加入100μl細(xì)胞懸液于未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室，分別作為Transwell侵襲及遷移模型。將兩組細(xì)胞于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉球拭去上室面細(xì)胞，PBS洗小室3次，10%甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，DM1000光學(xué)顯微鏡（200倍，德國Leica公司）下細(xì)胞計數(shù)，取5個隨機(jī)視野，計算其均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 Western blotting檢測

收集兩組6 cm培養(yǎng)皿中融合度＞80%的對數(shù)生長期細(xì)胞，1 ml細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）+1 mmol蛋白酶抑制劑（美國Amresco公司）重懸細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞1 h，4℃低溫高速離心機(jī)（德國 Eppendorf公司），13 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測總蛋白濃度。取40μg上樣量行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜，1∶1 000β-肌動蛋白（SAB3500350，美國Sigma公司）、基質(zhì)金 屬 蛋 白 酶 -2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）（M6184，美國Sigma公司）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）（M5177，美國 Sigma 公司）抗體室溫孵育相應(yīng)目的條帶2 h，PBS洗膜3次，1∶1 000羊抗兔IgG抗體（R1131，美國Sigma公司）孵育1 h，PBS洗膜3次。采用ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）孵育條帶30 s，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Invitrogen E-Gel Imager，美國 Thermo 公司）曝光目的條帶并掃描條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，比較用t檢驗或秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織及癌旁組織中LncRNA H19的比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，實驗組組織中LncRNA H19表達(dá)水平為0.214（0.282，0.132），對照組組織中為0.103（0.139，0.055），經(jīng)秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.375，P=0.000），實驗組高于對照組。見圖1。

圖1 食管癌組織及癌旁組織中LncRNA H19的比較

2.2 食管癌組織中LncRNA H19表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及組織分化程度患者的LncRNA H19高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而不同的年齡、性別、腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 兩組LncRNA H19蛋白表達(dá)水平比較

實驗組LncRNA H19蛋白表達(dá)水平為（0.835±0.117），對照組為（0.336±0.089），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.277，P=0.004）。見圖 2。

表1 不同影響因素患者的LncRNA H19高表達(dá)率比較

圖2 兩組LncRNA H19蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

2.4 兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力比較

Transwell侵襲模型顯示，實驗組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（59.28±9.57）個，對照組（37.44±6.26）個，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.271，P=0.003）。實驗組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)（143.10±17.92）個，對照組（68.16±10.35）個，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.097，P=0.000）。見圖 3。

圖3 兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力比較 （×200）

2.5 兩組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，實驗組MMP-2相對表達(dá)量為（0.383±0.049），對照組為（0.147±0.030），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.433，P=0.001）；實驗組MMP-9相對表達(dá)量為（0.724±0.095），對照組為（0.408±0.063），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.801，P=0.003）。見圖 4。

圖4 兩組MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

3 討論

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄長度＜200 bp的非編碼RNA，可通過多種表觀遺傳機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。LncRNA H19作為LncRNA中的一員，參與哺乳動物早期胚胎發(fā)育，并在組織器官成熟后表達(dá)下調(diào)。近年有研究顯示，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)重新上調(diào)，且參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等：①LncRNA H19高表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其表達(dá)與患者預(yù)后總生存時間呈負(fù)相關(guān)，另外LncRNA H19可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的惡性增殖[5-6]。②LncRNA H19在乳腺癌組織中高表達(dá)，其可通過下調(diào)E3泛素連接酶家族c-Cbl和Cbl-b的表達(dá)，抑制表皮生長因子受體泛素化過程，促進(jìn)其穩(wěn)定性，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力[7]。③LncRNA H19高表達(dá)于胃癌組織，且可促進(jìn)胃癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖轉(zhuǎn)移能力，胃癌患者組織及血漿中LncRNA H19的高表達(dá)均可提示患者預(yù)后不良[8-9]。④LncRNA H19還可通過介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition, EMT），促進(jìn)腫瘤組織體內(nèi)外生長，同時LncRNA H19還可作為結(jié)直腸癌進(jìn)展及患者不良預(yù)后的標(biāo)志物[10-11]。⑤LncRNA H19還可通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞增殖及侵襲能力[12]。上述研究均提示LncRNA H19可作為原癌基因發(fā)揮作用，但其在食管癌中表達(dá)的臨床意義及對食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響尚不明確。

本研究顯示LncRNA H19在食管癌組織中高表達(dá)，提示LncRNA H19可能參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，同時LncRNA H19的表達(dá)與患者組織分化、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)LncRNA H19的患者傾向于較低的組織分化程度，提示LncRNA H19對食管癌惡性轉(zhuǎn)化可能存在促進(jìn)作用，較高的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率表明LncRNA H19可能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步明確LncRNA H19對食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，筆者在TE1細(xì)胞中外源性上調(diào)LncRNA H19的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲及遷移能力均增強(qiáng)。MMP-2、MMP-9為金屬基質(zhì)蛋白酶家族成員，兩者可相互作用，共同促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，且可通過促進(jìn)細(xì)胞EMT的發(fā)生，介導(dǎo)細(xì)胞活性的增強(qiáng)。有研究顯示，MMP-2及MMP-9在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移的過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。筆者對LncRNA H19促食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)LncRNA H19后，MMP-2、MMP-9表達(dá)升高，提示LncRNA H19可通過促進(jìn)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)模型基底膜的降解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞活性，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。

綜上所述，本研究明確LncRNA H19在食管癌組織中的高表達(dá)水平及其對食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，但LncRNA H19與食管癌體內(nèi)外增殖的關(guān)系尚不清楚。筆者擬在接下來的研究中擴(kuò)大臨床標(biāo)本數(shù)量，并通過體外實驗明確其與食管癌體內(nèi)外生長的關(guān)系，為LncRNA H19的食管癌診斷試劑盒及靶向藥物研發(fā)提供新依據(jù)。