譚 遙 盧 喜 吳萬(wàn)艷 帕力達(dá)·阿皮孜阿吉 伊斯刊達(dá)爾·阿不力米提

食管癌(esophageal cancinoma)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病第8位，惡性腫瘤死亡的第8位，2017《中國(guó)腫瘤年報(bào)》報(bào)道，食管癌在我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均位列第四位，惡性程度極高，嚴(yán)重危害人類健康[1]。Let-7miRNA是目前已知的最大的miRNA家族，以往let-7miRNA被認(rèn)為是一種抑癌基因[2]，在食管癌細(xì)胞中表達(dá)水平較低，參與食管癌細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂相關(guān)的基因調(diào)控，抑制腫瘤血管生成、影響癌細(xì)胞的侵襲能力，食管癌中持續(xù)let-7miRNA低表達(dá)被認(rèn)為是預(yù)后較差的因素之一[3-7]。然而近期的研究提示let-7miRNA可能與細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，Elena等[8]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，let-7miRNA可能是細(xì)胞免疫的重要調(diào)節(jié)分子，T淋巴細(xì)胞幼稚狀態(tài)的維持需要較高水平的let-7miRNA，活化的CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著減低，通過(guò)調(diào)整其表達(dá)，可以調(diào)節(jié)CD8+T的增殖和活化。Baer等[9]的團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)，降低腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA的表達(dá)可以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞免疫功能下降一直被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的原因之一，免疫治療也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其在傳統(tǒng)治療外為腫瘤患者尋找更多的治療方案。本文通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，初步探索食管癌細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA表達(dá)水平對(duì)CD8+T細(xì)胞活化及功能的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系HEsEpiC，食管鱗狀細(xì)胞癌系Eca109，食管鱗狀細(xì)胞癌系TE-1。HEsEpiC用含10%胎牛血清的EpiCM培養(yǎng)液，TE-1及Eca109用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，均在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。

1.2 RNA提取及l(fā)et-7miRNA檢測(cè)

RNA提?。篢rizol試劑提取總RNA，整個(gè)操作過(guò)程均在冰上進(jìn)行，提取的RNA分光光度儀測(cè)OD值確定RNA質(zhì)量及完整性。

Let-7miRNA檢測(cè)：分別取HEsEpiC、Eca109、TE-1總RNA 2 μg，采用let-7和U6(內(nèi)參)的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA作為模板，熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)let-7miRNA表達(dá)。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)平行孔，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，熒光檢測(cè)，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。并繪制溶解曲線，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以2-△△ct法來(lái)計(jì)算正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系與食管鱗癌細(xì)胞系中的let-7miRNA表達(dá)量比值。

1.3 Let-7miRNA表達(dá)差異對(duì)CD8+T細(xì)胞激活影響

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞提取 5名健康志愿者空腹抽取肘靜脈外周血5 ml，肝素鈉抗凝，密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，置于10% 胎牛血清(FBS) 1640培養(yǎng)液中，5%CO2，37 ℃孵育箱中備用。

1.3.2 Let-7inhibitor、Let-7mimic細(xì)胞建立 提前一天將TE-1細(xì)胞接種于12孔板，1×105個(gè)/孔；轉(zhuǎn)染前，棄去培養(yǎng)基，加入800 μl Opti-MEM培養(yǎng)基；13 μl轉(zhuǎn)染試劑Hyperfect 2000及2.5 μg 質(zhì)?；騧imic、NC、inhibitor(50 nM)加入到含200 μl Opti-MEM的RNase free中，漩渦振蕩混勻，室溫靜止10～15 min；將混和液加入到12孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；更換培養(yǎng)基，37 ℃5% CO2孵育48 h。

1.3.3 共培養(yǎng)體系CD8+T細(xì)胞活化及效應(yīng)因子檢測(cè)

取TE-1、let-7inhibitor、let-7mimic與PBMC共同培養(yǎng)反應(yīng)體系各100 μl(1∶50，24 h)。采用FITC anti-human CD8a Antibody、PE anti-human CD71 Antibody、PE anti-human CD69 Antibody表面染色4 ℃孵育20 min，洗滌2次，離心，去上清；100 μl PBS和300 μl 4%多聚甲醛，4 ℃固定25 min；破膜液破膜、離心，去上清，PBS洗滌2次，PE anti-human IFN-γ Antibody、PE anti-human Perforin Antibody，4 ℃避光孵育30 min，洗滌2次；PBS制備細(xì)胞懸液，BD FACSCalibur檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

Let-7miRNA表達(dá)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異采用Graphpad Prism6，Demo軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CD8+T細(xì)胞CD71，CD69，IFN-γ,Perforin差異分析采用Florjo 7.6.1軟件分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Let-7miRNA表達(dá)差異

分別檢測(cè)HEsEpiC、Eca109、TE-1 細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA轉(zhuǎn)錄水平，HEsEpiC(16.11±2.073)，Eca109(1.67±0.912)、TE-1(1.01±0.123)，Eca109、TE-1腫瘤細(xì)胞let-7miRNA表達(dá)水平均顯著低于正常食管上皮細(xì)胞(P=0.007，0.000)，食管癌細(xì)胞株的let-7miRNA處于低表達(dá)狀態(tài)(圖1)。

圖1 HEsEpiC、Eca109、TE-1 細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA表達(dá)

2.2 Let-7miRNA表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞活化影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染法干擾TE-1細(xì)胞系let-7miRNA表達(dá)，不同表達(dá)組分別于PBMC共同培養(yǎng)24 h，檢測(cè)不同培養(yǎng)系中CD8+T細(xì)胞活化相關(guān)分子CD69、CD71表達(dá)，Control與inhibitor未見(jiàn)顯著差異(P=0.058,0.160)、inhibitor與mimc組，control與mimc組間，CD69、CD71表達(dá)差異存在顯著差異(P=0.003，0.007和P=0.000，0.001)(圖2、3)，食管癌細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞活化能力呈正相關(guān)，能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的激活。

圖2 Let-7miRNA表達(dá)水平對(duì)CD8+T CD69表達(dá)影響

圖3 Let-7miRNA表達(dá)水平對(duì)CD8+T CD71表達(dá)影響

2.3 Let-7miRNA表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)影響

分別取let-7miRNA表達(dá)共培養(yǎng)體系，檢測(cè)不同培養(yǎng)系中CD8+T細(xì)胞效應(yīng)相關(guān)產(chǎn)物干擾素-γ(IFN-γ)，穿孔素(Perforin)的表達(dá)，IFN-γ在mimic組中的表達(dá)高于對(duì)照組和抑制組(P=0.023，0.001)，在三組中為最高；模擬組中穿孔素也顯著高于其他兩組，抑制組中IFN-γ、穿孔素表達(dá)均為3個(gè)中最低(P=0.006，0.000)(圖4)。食管癌腫瘤細(xì)胞中的let-7miRNA表達(dá)水平可以影響CD8+T細(xì)胞效應(yīng)分子分泌，進(jìn)而影響CD8+T細(xì)胞殺傷功能。

圖4 Let-7miRNA表達(dá)水平對(duì)CD8+T分泌IFN-γ，Perforin的影響

3 討論

食管癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率顯著高于發(fā)達(dá)國(guó)家，2013年全球死于食管癌的為440 000人[1]。我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一，年平均死亡率為14.59/10萬(wàn)[10]。目前食管癌的治療仍以手術(shù)、放療、化療為主，經(jīng)過(guò)幾十年的改進(jìn)，療效仍不盡如人意，晚期食管癌的5年總生存率(overall survival,OS)徘徊在15%～20%之間，根治性的放療、同步放化療等治療手段在一定程度上改善了預(yù)后，5年0S提高至40%～47%[11-12]。新的治療途徑，尤其是免疫治療的興起，讓我們看到了食管癌治療的希望，目前已經(jīng)有將PD-1、PD-L1用于食管癌治療的臨床實(shí)驗(yàn)，有望改善食管癌的預(yù)后[13-15]，對(duì)新的免疫調(diào)節(jié)點(diǎn)的研究也從未停止過(guò)。

Let-7miRNA作為1個(gè)古老的RNA家族，人們一直在探索其功能，既往的研究主要集中于其抑癌的作用方面，認(rèn)為其在腫瘤中存在低表達(dá)的情況，在乳腺癌、肺癌中的表達(dá)水平可能與預(yù)后直接相關(guān)，食管癌中的持續(xù)低表達(dá)可能提示預(yù)后不良[4-5,16-17]。在腫瘤分發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，let-7miRNA靶向調(diào)節(jié)的癌基因在成熟的組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，但在腫瘤形成過(guò)程中出現(xiàn)表達(dá)或者表達(dá)升高。在白血病和前列腺癌的研究中又得到了不同的結(jié)果[18]。除此之外，也有研究提示let-7miRNA調(diào)控的靶基因產(chǎn)物高遷移率蛋白A1,A2(high mobility group A1,A2 HMGA1,HMGA2)與腫瘤的遷移能力密切相關(guān)，在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中存在顯著高表達(dá)狀態(tài)[7,19-20]。同時(shí)，let-7miRNA也可以通過(guò)調(diào)整細(xì)胞周期蛋白D2(cyclinD2，CCND2)使腫瘤細(xì)胞停止在G1/S階段。在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制不盡相同，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化的過(guò)程[21]。近期的一些研究欣喜的發(fā)現(xiàn)let-7miRNA在細(xì)胞免疫方面也有作用，Zhang等[22]報(bào)道let-7miRNA可以調(diào)節(jié)CD62-L、CD69表達(dá)，從而影響CD8+T細(xì)胞的遷移能力。Elena等[8]則發(fā)現(xiàn)，維持幼稚的淋巴細(xì)胞狀態(tài)，需要高水平的let-7miRNA表達(dá)，細(xì)胞成熟后表達(dá)則顯著降低，通過(guò)改變CD8+T細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA的表達(dá)水平，可以觀察到其增殖、分化和功能的變化，let-7miRNA可能是CD8+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的潛在位點(diǎn)，進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)機(jī)制可能是激活Eomes的靶基因?qū)崿F(xiàn)的。

本研究檢測(cè)了較為常見(jiàn)的食管癌Eca109、TE-1細(xì)胞株中的let-7miRNA的表達(dá)水平并與正常食管上皮細(xì)胞HEsEpiC進(jìn)行比較，證實(shí)其在食管癌細(xì)胞中的低表達(dá)。進(jìn)一步選取表達(dá)水平居中的TE-1，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法改變其let-7miRNA表達(dá)水平，并與志愿者PBMC共同培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)與CD8+T細(xì)胞活化相關(guān)的CD69、CD71，殺傷功能相關(guān)的IFN-γ，Perforin的水平[23],初步分析食管癌細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，let-7miRNA水平的升高可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化并提高其細(xì)胞殺傷功能。let-7miRNA高表達(dá)組培養(yǎng)體系中CD8+T中細(xì)胞CD69、CD71及IFN-γ，Perforin的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和低表達(dá)組，低表達(dá)組的相應(yīng)細(xì)胞因子及效應(yīng)分子則明顯降低，提示其表達(dá)與CD8+T細(xì)胞的活化和功能水平呈正相關(guān)。這一現(xiàn)象與let-7miRNA調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞激活和功能的研究結(jié)論相似，提示食管癌細(xì)胞中l(wèi)et-7miRNA表達(dá)水平降低可能是其在腫瘤形成過(guò)程中逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視的途徑之一。也間接的印證了持續(xù)低表達(dá)的食管癌患者預(yù)后差的可能原因，由于本研究是在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，有一定的局限性，進(jìn)一步在食管癌患者組織標(biāo)本及血液標(biāo)本中檢測(cè)let-7miRNA的表達(dá)水平，并研究其相關(guān)的靶基因和細(xì)胞通路分子在患者體內(nèi)的表達(dá)情況，有望更加深入的揭示其作用機(jī)制。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討了let-7miRNA表達(dá)對(duì)細(xì)胞免疫的影響。在食管癌細(xì)胞中，let-7miRNA的表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞活化和殺傷功能呈正相關(guān)。Let-7miRNA可能是食管癌患者細(xì)胞免疫的潛在調(diào)節(jié)位點(diǎn)之一，值得進(jìn)一步深入研究。