劉 中，產(chǎn)進(jìn)中，黃 俊，張 麗，張 野，何淑芳

心肌在缺血基礎(chǔ)上血流再灌注后損傷反而加重，稱為心肌缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)。在急性心肌梗死溶栓治療、介入治療以及心臟外科中常常發(fā)生再灌注損傷，導(dǎo)致心肌損傷加重，嚴(yán)重影響心功能恢復(fù)。Murry et al[1]首次提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)的概念，證實IPC可以減輕IRI，是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌保護(hù)方法，但至今具體的作用機(jī)制仍未完全明確。

外泌體是一種囊泡樣小體，其中包含了豐富的蛋白質(zhì)、核酸，可傳輸多種信號分子，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要物質(zhì)[2]。大量研究[3-4]顯示，干細(xì)胞來源的外泌體，可作用于受損的心肌組織，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少梗死面積，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。然而，外泌體是否參與介導(dǎo)了IPC的心肌保護(hù)作用，尚未可知。該研究擬探討IPC誘導(dǎo)的外泌體對H9c2心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation , H/R)損傷以及凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)表達(dá)的影響，以期為IPC心肌保護(hù)機(jī)制研究提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與細(xì)胞株 健康成年雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(250±30) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物隨機(jī)分為對照組(CON組)和IPC組，每組3只。大鼠H9c2(2-1)胚胎心肌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 無外泌體血清、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution試劑盒購自美國SBI公司；DME/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；鼠抗HSP60單克隆抗體購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司；Bcl-2、Bax 單克隆兔抗購自美國CST公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖檢驗試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自廣州Biosharp公司；乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；FITC Annexin V凋亡試劑盒購自美國BD公司；低氧小室購自加拿大Stem Cell公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；蛋白電泳儀、Tanon Fine Do X6全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海Tannon公司；Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠缺血預(yù)處理 參考文獻(xiàn)[5]，建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥50 mg/kg進(jìn)行麻醉，氣管插管后，連接小動物呼吸機(jī)。于左鎖骨中線處切開皮膚2 cm，在第4、5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓大鼠胸廓，擠出心臟，在肺動脈圓錐與左心耳之間冠狀動脈左前降支處用6-0 Prolene線進(jìn)針作一線結(jié)，回納心臟于胸腔，穩(wěn)定15 min后開始心臟缺血再灌注損傷實驗，收緊線結(jié)即為結(jié)扎左冠狀動脈前降支致心肌缺血，松開線結(jié)即為心肌再灌注。對心肌進(jìn)行缺血5 min，再灌注5 min，3個循環(huán)，即為IPC。對照組大鼠麻醉后，僅穿線不結(jié)扎。

1.2.2血清外泌體提取 預(yù)處理結(jié)束后收集大鼠血液，采用ExoQuickTM試劑盒提取血清中的外泌體。血清以 5 686 r/min離心15 min去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，留取上清液；上清經(jīng)過0.22 μm一次性濾器過濾，所得上清液按照試劑盒說明書，加入沉淀劑，混合均勻后，4 ℃孵育30 min；隨后將孵育好的混合物在4 ℃、4 021 r/min離心30 min，離心后外泌體呈米黃色或白色沉淀沉于管底；棄上清液，再次 4 021 r/min離心5 min，留取沉淀，即為外泌體，用400 μl PBS或DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，分別標(biāo)記為IPC-Exo和CON-Exo，保存于-80 ℃。

1.2.3外泌體濃度測定 采用BCA蛋白定量法測定外泌體濃度，嚴(yán)格按照BCA試劑盒的說明書測定樣品的濃度。將0.5 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl順序加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，各孔加入PBS補(bǔ)足到20 μl；上述提取的外泌體樣品稀釋10倍后，取5 μl加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足到20 μl；各孔加BCA工作液200 μl，用加樣槍輕輕吹打混勻；37 ℃孵育30 min后放入酶標(biāo)儀，于波長570 nm處測定各孔的吸光度值。

1.2.4Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白HSP60 上述提取的兩組外泌體樣品，取100 μl，加入RIPA裂解液冰上裂解隨后與5×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃煮10 min，制成蛋白樣品。取20 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含5%脫脂牛奶的TBST液中室溫孵育1～2 h，TBST液漂洗3次，每次10 min，加入HSP60一抗 (1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日TBST液漂洗3次，每次10 min，加二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL發(fā)光試劑盒顯影并采集圖像。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞用含10%無外泌體血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。當(dāng)細(xì)胞密度在80%左右時，用0.25%胰酶消化1 min左右，以1 ∶3的比例傳代，每隔2～3 d傳代1次。

1.2.6建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型 參照文獻(xiàn)[6]中方法，換去H9c2細(xì)胞正常培養(yǎng)時的完全培養(yǎng)基，加入無血清無糖的低氧液(139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES，pH 7.4)，細(xì)胞置于低氧小室中，通入95%N2-5%CO2飽和10 min以驅(qū)除小室內(nèi)的氧氣，隨后將低氧小室放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h進(jìn)行低氧處理，然后用含10%無外泌體血清的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)1 h進(jìn)行復(fù)氧。

1.2.7實驗分組及處理 H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：① 對照組(Control組)：H9c2細(xì)胞置于DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；② 低氧/復(fù)氧組(H/R)：將H9c2細(xì)胞進(jìn)行5 h低氧和1 h復(fù)氧處理；③ H/R+IPC-Exo組：將MPC-Exo以20 mg/L的終濃度加入H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，與心肌細(xì)胞共孵育12 h后，進(jìn)行H/R處理；④ H/R+CON-Exo組：將CON-Exo以20 mg/L的終濃度加入H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，與心肌細(xì)胞共孵育12 h后，進(jìn)行H/R處理。

1.2.8心肌細(xì)胞活力的檢測 將H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔8×103個，按上述方法進(jìn)行分組及處理完成后，每孔加入10 μl CCK-8溶液(此時培養(yǎng)基為100 μl)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，酶標(biāo)儀上于波長450 nm處測定各組吸光度值，空白對照孔為不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。H9c2心肌細(xì)胞活力為實驗測定孔吸光度值減去空白對照孔吸光度值。計算各組平均值。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.9檢測LDH活性 接種在96孔板的H9c2細(xì)胞按照以上進(jìn)行分組及處理完成后，每組各取40 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定各孔吸光度值，然后根據(jù)公式計算各組LDH活性。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.10Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡將H9c2心肌細(xì)胞以3×106個/孔接種在6孔培養(yǎng)板，按照上述進(jìn)行分組及處理完成后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用100 μl 1×緩沖液重懸細(xì)胞，每組加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻后，室溫避光反應(yīng)15 min，每組再加入400 μl緩沖液重懸細(xì)胞，隨后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。以單染PI細(xì)胞和單染Annexin-V-FITC細(xì)胞作為基準(zhǔn)參照，每個樣本獲取3×104個細(xì)胞，用FCS Express V 4.0軟件進(jìn)行分析。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.11Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 按照上述分組及處理結(jié)束后，提取各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白，制備蛋白樣品。取20 μg蛋白樣品經(jīng)電泳后，轉(zhuǎn)膜，后在含5%脫脂牛奶的TBST封閉液中室溫孵育1～2 h，TBST液漂洗3次，每次10 min，加入Bcl-2、Bax一抗 (1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日TBST液漂洗3次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL發(fā)光試劑盒顯影并采集圖像。采用Image J軟件進(jìn)行分析，以Bcl-2或Bax與β-actin條帶灰度值之比來表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1IPC對外泌體釋放的影響采用BCA蛋白定量法測定血清外泌體濃度，結(jié)果表明CON-Exo濃度為(7.46± 1.77)mg/ml，IPC-Exo濃度為(14.93±1.27)mg/ml，提示IPC可誘導(dǎo)血清外泌體釋放顯著增加(P<0.01)，見圖1A。Western blot 結(jié)果顯示IPC-Exo、CON-Exo均表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白HSP60，見圖1B，且IPC后提取的外泌體中HSP60蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)。

圖1 IPC對外泌體釋放的影響

A:兩組外泌體濃度統(tǒng)計分析圖；B: Western blot檢測血清外泌體標(biāo)志蛋白HSP60，且IPC后提取的外泌體中HSP60蛋白表達(dá)水平增加；與CON-Exo組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響H9c2細(xì)胞活力檢測結(jié)果如圖2所示，與CON組(1.14± 0.09)相比，H/R組(0.47±0.08)細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)；與H/R組比較，H/R+IPC-Exo組(0.78±0.04)細(xì)胞活力增加(F=169.1，P<0.01)；而H/R+CON-Exo組(0.51± 0.11)細(xì)胞活力無明顯增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明IPC-Exo可以明顯增加細(xì)胞活力。

2.3IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性的影響細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的水平可以用來表示細(xì)胞損傷的程度，各組測得結(jié)果分別為CON組(67.33±9.71)、H/R組(166.00 ±12.17)、H/R+IPC-Exo組(111.33± 11.68)、H/R+CON-Exo組(149.67± 13.80)。如圖3所示，與CON組比較，H/R組心肌細(xì)胞H/R損傷后LDH活性明顯增加(P<0.01)；與H/R組比較，H/R+IPC-Exo組可減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，降低H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性(F=40.73，P<0.05)。而H/R+CON-Exo組LDH活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示IPC-Exo能夠降低H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性。

圖2 IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

1：CON組；2：H/R組；3：H/R+IPC-Exo組；4：H/R+CON-Exo組；與CON組比較：##P<0.01；與H/R組比較：**P<0.01

圖3 IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞LDH的活性的影響

1：CON組；2：H/R組；3：H/R+IPC-Exo組；4：H/R+CON-Exo組；與CON組比較：##P<0.01；與H/R組比較：*P<0.05

2.4IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明，與CON組比較，H/R組凋亡細(xì)胞(右上象限、右下象限)明顯增多(P<0.01)；與H/R組比較，H/R+IPC-Exo組凋亡細(xì)胞明顯減少(F=13.63，P<0.05)；而H/R+CON-Exo組心肌細(xì)胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4，表明IPC-Exo可以抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

2.5IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果表明，與CON組比較，H/R組心肌細(xì)胞H/R損傷后Bcl-2表達(dá)明顯減少(F=5.736，P<0.05)，Bax表達(dá)增加(F=26.02，P<0.01)，而H/R+IPC-Exo組Bcl-2表達(dá)增加、Bax表達(dá)減少，與H/R組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而H/R+CON-Exo組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5，說明IPC-Exo能上調(diào)H9c2細(xì)胞Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)。

圖4 IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

1：CON組；2：H/R組；3：H/R+IPC-Exo組；4：H/R+CON-Exo組；與CON組比較：##P<0.01；與H/R組比較：*P<0.05

3 討論

近年來，外泌體在心血管疾病中的作用得到廣泛關(guān)注，外泌體在缺血性心臟病中的重要作用逐漸得到認(rèn)識。研究[4]顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能明顯減小小鼠的心肌梗死面積，通過增加ATP水平，減少氧化應(yīng)激，激活PI3K/Akt 通路，從而減輕IRI。同時有研究[7]表明，血漿外泌體可以介導(dǎo)蛋白HSP70的轉(zhuǎn)運(yùn)，激活心肌細(xì)胞內(nèi)ERK和p38 MAPK信號通路從而減輕I/R損傷，從而起到心肌保護(hù)作用。此外，心臟祖細(xì)胞來源的外泌體在小鼠心肌梗死中也發(fā)揮作用，可抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積，改善心臟功能[8]。以上研究均表明，外泌體在缺血性心臟病中具有心肌保護(hù)作用，這為IRI后心肌修復(fù)治療提供了新策略和新思路。

IPC是指反復(fù)幾次短暫缺血再灌注后，可誘導(dǎo)心臟產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使其對后面較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生明顯的耐受，顯著減少心律失常的發(fā)生以及減輕梗死面積。然而IPC減輕IRI的確切機(jī)制仍未完全闡明。研究[9]表明主要是涉及細(xì)胞因子、凋亡基因、激活激酶途徑等。進(jìn)一步深入研究IPC的作用機(jī)制，將促進(jìn)其在心肌梗死、心臟再灌注等臨床治療中的應(yīng)用，為預(yù)防或減輕IRI提供新靶點。本研究通過在大鼠體內(nèi)進(jìn)行IPC，預(yù)處理結(jié)束后收集血液，隨后分別提取CON組和IPC組血清中的外泌體，采用BCA蛋白定量法測定血清中外泌體濃度，結(jié)果表明IPC組外泌體濃度明顯高于CON組，表明IPC可刺激內(nèi)源性外泌體的釋放，從而增加其在血清內(nèi)的含量。外泌體含量及內(nèi)容物的變化，可以反映機(jī)體的生理病理狀態(tài)，對機(jī)體產(chǎn)生不同的影響[10]。Giricz et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，離體灌流的供體心臟經(jīng)過IPC處理后，其冠脈流出液中的細(xì)胞外囊泡(其中包含外泌體)，可以減輕受體心臟的IRI損傷。此外有研究[12]顯示，缺血預(yù)處理可以刺激富含miRNA-144的外泌體的釋放，而miRNA-144激活PI3K/Akt和ERK信號通路，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

圖5 IPC-Exo對H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

A：Bcl-2；B：Bax；1：CON組；2：H/R組；3：H/R+IPC-Exo組；4：H/R+CON-Exo組；與CON組比較：#P<0.05，##P<0.01；與H/R組比較：*P<0.05

為進(jìn)一步探討IPC誘導(dǎo)釋放的血清外泌體對H/R損傷的影響，將IPC-Exo與H9c2心肌細(xì)胞共孵育12 h，隨后進(jìn)行H/R損傷，研究結(jié)果表明，IPC-Exo能增加H9c2心肌細(xì)胞活力，降低LDH的活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，而CON-Exo并未有此作用。心肌細(xì)胞凋亡是IRI中重要的損傷環(huán)節(jié)，在其發(fā)生中扮演著重要角色。研究[13]表明，細(xì)胞凋亡是一種受多基因控制的程序性死亡，并且Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，主要通過抑制細(xì)胞色素c的釋放來調(diào)節(jié)凋亡[14]。相反，Bax是促細(xì)胞凋亡基因，可抑制Bcl-2活性或作用于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔導(dǎo)致線粒體通透性改變，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果表明，H/R組心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞凋亡率明顯增加，而H/R+IPC-Exo組凋亡細(xì)胞明顯減少，同時顯示H/R組Bcl-2表達(dá)明顯減少，Bax表達(dá)增加，而H/R+IPC-Exo組Bcl-2表達(dá)增加、Bax表達(dá)減少，表明IPC-Exo能上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。據(jù)此，推測IPC-Exo可以減輕H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。然而，本研究主要在H9c2細(xì)胞上進(jìn)行的，H9c2細(xì)胞是大鼠胚胎心肌細(xì)胞株，但其不同于原代的乳鼠心肌細(xì)胞和成年心肌細(xì)胞，因此IPC誘導(dǎo)釋放的血清外泌體是否能夠減輕原代心肌細(xì)胞H/R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，有待于進(jìn)一步研究。此外本研究只觀察了Bcl-2和Bax的變化，探討了初步的分子機(jī)制，具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。