黃舒穎，張 誠，黃自坤，羅 清，卿 城

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織公布的報(bào)告表明，目前全球每年約有150～200萬人死于結(jié)核病，高居單一病原致患者死亡的感染性疾病之首。我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病患病人數(shù)居世界第三位[1]。近年來由于耐藥菌株的不斷增多、人口流動(dòng)性加大以及HIV的蔓延，使得結(jié)核病的防治更加迫在眉睫。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是一類胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于感染受體的巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此機(jī)體抗結(jié)核免疫主要依賴于細(xì)胞免疫。遺憾的是，對(duì)MTB感染后相關(guān)免疫反應(yīng)及免疫逃逸的機(jī)制至今尚未闡明，使得結(jié)核病的防治至今未再次獲得突破性進(jìn)展。

長鏈非編碼RNA (long-noncoding RNA, lncRNA)是一類廣泛存在的長度大于200 nt非編碼RNA，缺乏開放讀碼框，而是利用與RNA、DNA或者蛋白的相互作用，對(duì)靶分子進(jìn)行核酸降解、干擾RNA翻譯等方式在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、損傷、自噬和分化等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控，在免疫、腫瘤、心血管[2]等多種疾病中發(fā)揮重要作用。lncRNA NEAT1是近期研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的細(xì)胞功能調(diào)控因子，在卵巢癌[3]、前列腺癌[4]等腫瘤疾病的形成、分化及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。重要的是，NEAT1參與了機(jī)體固有免疫過程，是體內(nèi)重要的免疫正向調(diào)節(jié)因子。在感染性疾病中，NEAT1參與了人體HIV[5]、漢坦病毒[6]、寨卡病毒[7]感染過程。在免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NEAT1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究顯示NEAT1可調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞炎癥因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、CXCL10表達(dá)[8]。由于細(xì)胞因子IL-6和CXCL10與MTB感染后巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此，NEAT1可能參與了巨噬細(xì)胞抗MTB的免疫過程。該研究采用H37Rv菌株構(gòu)建感染巨噬細(xì)胞模型，檢測(cè)NEAT1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，另一方面利用RNAi 干擾沉默巨噬細(xì)胞NEAT1表達(dá)，檢測(cè)H37Rv感染后IL-6表達(dá)及其對(duì)H37Rv殺菌功能影響，初步探討NEAT1在結(jié)核病免疫反應(yīng)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與主要試劑RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294)由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；TRIzol 試劑和LipofectmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司; PCR引物購自上海生工生物工程公司；IL-6 ELISA試劑盒購自上海明睿生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物TaKaRa公司；siRNA 干擾試劑購自廣州銳博公司；熒光定量PCR采用美國ABI公司(Applied Biosystems 7600系統(tǒng))。其它所用試劑均為分析純。

1.2感染模型的建立選取對(duì)數(shù)期生長的RAW264.7巨噬細(xì)胞加入24孔板，置于 37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁良好后，將H37Rv按一系列感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行感染，4 h后將胞外未感染的細(xì)菌用PBS洗去，然后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)，12 h后TRIzol提取細(xì)胞總RNA；或采用MOI=5對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行感染，并于感染后4 h將胞外未感染的細(xì)菌用PBS洗去，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、48 h)TRIzol分別提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞NEAT1表達(dá)情況，ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-6含量。

1.3總RNA提取TRIzlo法提取總RNA，具體參考試劑說明書。

1.4RT-qPCRcDNA逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，所有操作條件按說明書進(jìn)行。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。NEAT1 上游引物：5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCC-ATTCAC-3′， 下游引物 ：5′ -CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3′[8]； qPCR 反應(yīng)采用 SYBR Premix EX TaqTMⅡ，使用ABI 7500 系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)，具體的檢測(cè)步驟及反應(yīng)條件設(shè)置都按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有樣品做 3 復(fù)孔，RNA相對(duì)表達(dá)量以 2-ΔΔCt方法計(jì)算所得。

1.5IL-6蛋白測(cè)定ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-6濃度，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.6siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備NEAT1 siRNA以及control siRNA(siNC)，具體由上海Gene Pharma公司完成。siRNA引物序列[8]：正義序列：5′-GUGAGA AGUUGCUUAGAAACUUUCC -3′，反義序列：5′-GGA AAGUUUCUAAGCAACUUCUCACUU-3′。巨噬細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、siNC轉(zhuǎn)染組以及siNEAT1轉(zhuǎn)染組。巨噬細(xì)胞貼壁良好后，siNEAT1或siNC轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞放在孵箱中培養(yǎng)4～6 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)siRNA敲減效果。

1.7siNEAT1對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6分泌影響NEAT1沉默后的RAW264.7巨噬細(xì)胞，將H37Rv按MOI=5的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，48 h后ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的含量。

1.8siNEAT1對(duì)巨噬細(xì)胞對(duì)H37Rv殺菌功能檢測(cè)巨噬細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、siNC轉(zhuǎn)染組以及siNEAT1轉(zhuǎn)染組；NEAT1沉默后的RAW264.7巨噬細(xì)胞，將H37Rv按MOI=5的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，4 h后用PBS洗去胞外未感染的H37Rv，該時(shí)間點(diǎn)設(shè)為H37Rv感染后0 h。分別于H37Rv感染后0 h、72 h收集并裂解各組細(xì)胞，將裂解液進(jìn)行系列梯度稀釋，接種于含有 OADC的7H10固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng) 3～4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1H37Rv感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后NEAT1表達(dá)和IL-6分泌情況如圖1所示，MTB感染巨噬細(xì)胞后，RT-qPCR檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)NEAT1表達(dá)顯著上調(diào)，與空白對(duì)照組表達(dá)為1.0相比，12、24、48 h分別上調(diào)(5.83±1.21)、(5.25±0.98)、(4.62±0.93)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.55，P<0.01)。 ELISA檢測(cè)表明，未感染時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的濃度為(186.43±28.09 )pg/ml，MTB感染48 h后IL-6濃度為(404.29±43.53)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.12，P<0.01)。

圖1 MTB感染巨噬細(xì)胞后NEAT1表達(dá)和IL-6分泌情況A：NEAT1；B：IL-6；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2NEAT1沉默后巨噬細(xì)胞IL-6分泌的變化RNAi轉(zhuǎn)染成功地沉默了巨噬細(xì)胞NEAT1表達(dá)(t=16.19，P<0.05)，見圖2A。將沉默NEAT1的RAW264.7巨噬細(xì)胞感染MTB后收集培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測(cè)IL-6分泌水平。從圖2B可見，正常對(duì)照細(xì)胞僅少量分泌IL-6 [(142.25±36.43)pg/ml]，感染MTB后分泌量升高[(405.26±23.80)pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.08，P<0.01)。沉默NEAT1后的巨噬細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染對(duì)照序列細(xì)胞(siNC)比較， IL-6分泌量顯著減少(t=4.45，P<0.01)。

圖2 ELISA檢測(cè)NEAT1沉默后感染MTB的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6分泌量變化

A：NEAT1；B：IL-6；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01；與siNC組比較：#P<0.05

2.3NEAT1沉默后巨噬細(xì)胞對(duì)H37Rv殺菌能力的影響以空白敲除組作為對(duì)照組，敲低NEAT1的RAW264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，分別感染H37Rv，0.1%SDS裂解細(xì)胞并接種于7H10固體培基，最后檢測(cè)荷菌量。結(jié)果顯示，H37Rv感染后0 h時(shí)，siNEAT1組與對(duì)照組細(xì)胞荷菌量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.03，P>0.05)，提示沉默NEAT1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬MTB功能無明顯影響。以0 h時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)MTB量為基準(zhǔn)，在MTB感染后72 h時(shí)，與對(duì)照組比較，siNEAT1處理組巨噬細(xì)胞中MTB的存活率顯著上升(t=8.98，P<0.01)，見圖3，提示沉默NEAT1表達(dá)可顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)MTB的能力。

圖3 siNEAT1對(duì)RAW264.7細(xì)胞殺傷H37Rv影響的檢測(cè)結(jié)果與siNC 72 h組比較：**P<0.01

3 討論

lncRNA已被證實(shí)廣泛參與多種人類疾病的調(diào)控。lncRNA THRIL[9]參與巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌；lncRNA Cox2[10]可調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB與Toll樣受體信號(hào)通路，影響炎癥因子干擾素、趨化因子的表達(dá)等。此外，lncRNA在結(jié)核病免疫反應(yīng)過程中的作用也逐漸引起了關(guān)注。例如lncRNA CD244可從表觀遺傳水平調(diào)控結(jié)核感染過程中CD8+ T細(xì)胞IFN-γ和TNF-α分泌[11]。lncRNA MEG3敲除的巨噬細(xì)胞，其BCG清除能力顯著提高[12]。

NEAT1又稱為MENε /β或 VINC，是從人類第11號(hào)染色體上一個(gè)被稱為多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病(MEN)Ⅰ型的基因位點(diǎn)，由 RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，具有高度的人鼠同源性[13]。NEAT1有NEAT1-1(約3 700 bp)和NEAT1-2(約2 300 bp)兩個(gè)亞型。已有的研究[8]顯示，NEAT1-1是巨噬細(xì)胞的主要表達(dá)成分。因此本研究中直接選取檢測(cè)巨噬細(xì)胞中 NEAT1-1表達(dá)進(jìn)行相關(guān)研究。

NEAT1參與了機(jī)體的固有免疫反應(yīng)調(diào)控，是一個(gè)重要的促炎分子。Zhang et al[14]發(fā)現(xiàn)NEAT1在 HIV-1 感染患者的 T細(xì)胞中表達(dá)上升，敲除NEAT1 則會(huì)促進(jìn) HIV-1 mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的出核與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而促進(jìn)HIV-1病毒的復(fù)制。漢坦病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也會(huì)引起NEAT1表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染上調(diào)NEAT1可活化RIG-I/IRF7信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子IFN分泌[6]。Zhang et al[8]研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)刺激可提高巨噬細(xì)胞內(nèi)NEAT1的表達(dá)水平，高表達(dá)的NEAT1可通過調(diào)控JNK/ERK MAPK信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)。然而，目前尚未見有關(guān)NEAT1在結(jié)核病中的研究報(bào)道。

由于MTB是胞內(nèi)寄生菌，在其感染機(jī)體后主要寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此抗結(jié)核免疫研究最終還是要落實(shí)到巨噬細(xì)胞上來[15]。為了明確NEAT1在MTB感染中的作用，本研究首先采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了RAW264.7巨噬細(xì)胞在感染H37Rv后細(xì)胞NEAT1的表達(dá)。結(jié)果表明，MTB感染會(huì)誘導(dǎo)顯著上調(diào)NEAT1在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)IL-6分泌增加。這可能是由于免疫細(xì)胞感染MTB后，首先會(huì)迅速激活巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)包括IL-6在內(nèi)的多種促炎因子釋放，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)MTB的殺傷能力，阻止其廣泛播散。最近研究[11]表明NEAT1可通過調(diào)控JNK/ERK MAPK炎癥信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中檢測(cè)NEAT1沉默后巨噬細(xì)胞IL-6分泌量變化。結(jié)果顯示，siRNA敲除NEAT1后，使 IL-6分泌量下調(diào)。進(jìn)一步通過胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，敲除NEAT1后可顯著減弱RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)MTB的胞內(nèi)清除能力，進(jìn)一步證實(shí)了NEAT1參加MTB感染后的免疫過程。

綜上所述，本研究顯示MTB H37Rv感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)NEAT1表達(dá)顯著升高，炎癥因子IL-6分泌增加；沉默NEAT1會(huì)抑制巨噬細(xì)胞對(duì)MTB的清除能力。本研究提示NEAT1在結(jié)核病免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用，為結(jié)核病免疫治療提供了新的線索。