李 飛，周志強(qiáng)，吳成穩(wěn)，康海涵，梁曉丹，蔡亞征, 張 毅

血管瘤(hemangioma，HEM)是一種良性腫瘤，不僅影響患者的容貌，還能夠影響相關(guān)組織器官正常功能的發(fā)揮，HEM有較為明顯的消退期、平臺期和增生期，頭頸部的發(fā)病率最高，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(hemangioma endothelial cells,HEC)是HEM發(fā)生主要原因，誘導(dǎo)HEC凋亡是治療HEM的重要途徑[1-2]。胰腺癌缺失基因(deleted in pancreatic cancer locus 4,DPC4/Smad4)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長的作用，在白血病細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中已經(jīng)證實[3-5]。Smad4在增生期HEM組織中的表達(dá)水平低于退化期HEM組織，Smad4可能參與HEC凋亡[6]。該實驗通過體外分離培養(yǎng)增生期的HEC，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)HEC中Smad4的表達(dá)，探討Smad4在增生期HEC凋亡中的作用，為明確HEM發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量測定試劑盒購自上海翊圣生物公司；pcDNA3.1-Smad4由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室構(gòu)建；Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；ECL顯色試劑購自北京Solarbio公司；細(xì)胞周期測定試劑盒、細(xì)胞凋亡測定試劑盒購自上海碧云天公司；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)抗體購自美國CTS公司；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗體購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體購自天津saierbio公司；Smad4抗體購自美國ABACM公司。

1.2HEC分離培養(yǎng)及分組新鮮增生期HEM組織標(biāo)本來自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，組織采集經(jīng)患者及家屬同意。增生期HEC分離培養(yǎng)步驟同文獻(xiàn)[7]，取增生期HEM組織，用PBS反復(fù)洗滌至溶液清亮，把周圍的皮膚和脂肪組織去除，剪成大小約為1～2 cm3的組織碎塊，置于0.25%的胰蛋白酶中，在37 ℃的水浴中消化20 min。用含胎牛血清的M199終止消化，把消化后的組織塊剪碎成≤1 mm×1 mm×1 mm的小碎塊，種植到培養(yǎng)瓶內(nèi)，把培養(yǎng)瓶倒置培養(yǎng)10 min后，加入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液完全覆蓋組織塊，3 d后換液，6 d后把組織塊清除掉，9 d傳代培養(yǎng)(0.25%胰蛋白酶傳代)。HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Smad4組，同時把未做轉(zhuǎn)染處理的HEC記為Control組，具體轉(zhuǎn)染方法同Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書。

1.3qRT-PCR測定HEC中Smad4表達(dá)Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，以每106個細(xì)胞添加1 ml的TRIzol將各組HEC裂解以后，與200 μl的氯仿混合后，吸取上層水相溶液，再與500 μl的異丙醇混合，低溫，高速離心后，用75%的乙醇洗滌RNA，用RNase-free水溶解后，測定吸光度(optical density,OD)值260 nm和OD 280 nm的比值，比值介于1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：25 ℃、5 min；42 ℃、60 min；75 ℃、5 min。 取cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，步驟同試劑盒說明書，用2-ΔΔCt法計算各組樣品中Smad4水平，GAPDH為參照。

1.4Westernblot測定HEC中Smad4表達(dá)Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的PBS洗滌后，每個細(xì)胞瓶中添加含有PMSF的裂解液500 μl，放在冰上裂解30 min后，低溫高速離心10 min。把上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，用BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳電壓為90 V，每孔上樣量為30 μg。用半干法把凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，100 mA電流轉(zhuǎn)膜50 min。用5%牛血清白蛋白封閉后與抗體孵育，Smad4一抗1 ∶600稀釋，GAPDH一抗1 ∶1 000稀釋，二抗1 ∶2 000稀釋，DAB顯色。對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，目的蛋白同GAPDH內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT測定HEC增殖活性Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞種植到96孔板中，在第24、48、72、96小時取出培養(yǎng)板，在細(xì)胞內(nèi)加MTT溶液，培養(yǎng)4 h，將上清液去掉，再添加DMSO，用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm的OD值。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以后24 h，用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)，低速離心10 min，把上清液去掉，添加75%甲醇，置于4 ℃過夜反應(yīng)，低速離心10 min，加入PI，置于4 ℃反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀測定HEC周期。

1.7流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以后24 h，用胰蛋白酶消化，與400 μl的結(jié)合緩沖液混合后，再與PI和Annexin V-FITC反應(yīng)后，流式細(xì)胞儀檢測HEC凋亡。

1.8Westernblot檢測細(xì)胞中CleavedCaspase-3、CDK4、CyclinD1蛋白水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以后24 h，用胰蛋白酶消化，Western blot法檢測Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平，Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1一抗以1 ∶600稀釋，其他步驟同上。

1.9DCFH-DA法檢測細(xì)胞中ROS水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以后24 h，用DCFH-DA法檢測細(xì)胞中ROS水平，步驟同ROS含量測定試劑盒，以Control組為1，分析各組細(xì)胞ROS水平。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HEC中Smad4表達(dá)HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad4后，細(xì)胞中Smad4 mRNA和蛋白水平均升高，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC中Smad4 mRNA和蛋白水平?jīng)]有影響，見圖1、表1。

圖1 Western blot測定轉(zhuǎn)染后的HEC中Smad4蛋白表達(dá)情況

表1 各組HEC中Smad4水平

與Control組比較：*P<0.05

2.2Smad4對HEC增殖的影響HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad4后，細(xì)胞OD值降低，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC OD值沒有影響，見表2。過表達(dá)Smad4可以降低HEC的增殖活性。

2.3Smad4對HEC周期的影響HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad4后，細(xì)胞G0/G1期比例升高，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC周期沒有影響，見表3。過表達(dá)Smad4可以將HEC周期阻滯在G0/G1期。

2.4Smad4對HEC凋亡的影響HEC中轉(zhuǎn)染pcD-NA3.1-Smad4后，細(xì)胞凋亡率升高，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC凋亡率沒有影響，見圖2、表4。過表達(dá)Smad4誘導(dǎo)HEC凋亡。

表2 各組HEC OD值

與Control比較：*P<0.05

圖2 流式細(xì)胞儀測定Smad4誘導(dǎo)的HEC凋亡情況

表3 各組HEC周期

與Control組比較：*P<0.05

表4 各組HEC凋亡率

與Control組比較：*P<0.05

2.5Smad4對HEC中Caspase-3、CDK4、CyclinD1表達(dá)的影響HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad4后，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，CDK4、Cyclin D1蛋白水平下降，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平?jīng)]有影響，見圖3、表5。過表達(dá)Smad4誘導(dǎo)HEC中Caspase-3活化，減少細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1蛋白表達(dá)。

圖3 Western blot檢測HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

2.6Smad4對HEC中ROS水平的影響Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞中ROS水平依次為：1.00、(1.01±0.07)、(1.76±0.18)，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.853,P=0.000)。HEC中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad4后，細(xì)胞中ROS水平升高，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對HEC中ROS水平?jīng)]有影響， 見圖4。過表達(dá)Smad4誘導(dǎo)HEC中ROS合成。

表5 各組HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

與Control組比較：*P<0.05

圖4 各組HEC中ROS水平

3 討論

本實驗的結(jié)果顯示，Smad4過表達(dá)后的HEC中CDK4和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，提示Smad4通過減少CDK4和Cyclin D1表達(dá)阻滯HEC周期，抑制HEC增殖；同時結(jié)果還表明，Smad4過表達(dá)后的HEC中Caspase-3活化增多，細(xì)胞凋亡率升高，提示Smad4可以通過激活Caspase-3的活化誘導(dǎo)HEC凋亡；Smad4誘導(dǎo)HEC中ROS水平升高，這可能是Smad4誘導(dǎo)HEC凋亡的機(jī)制之一。

Smad名字來源于果蠅Mad蛋白和線蟲Sma蛋白，Smad蛋白家族在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)有關(guān)的效應(yīng)因子，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了至少9種Smad蛋白成員，Smad4是目前確認(rèn)的共同通道型Smad，是一種抑癌基因，可以與幾乎所有的活化途徑Smad蛋白相結(jié)合，形成低聚體的復(fù)合物，在TGF-β信號調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。Smad4含有一個MH2結(jié)構(gòu)域，MH2由β片層夾心、三環(huán)α螺旋和三螺旋束構(gòu)成，這個區(qū)域的氨基酸序列高度保守，在分子識別中具有重要作用，而這個區(qū)域內(nèi)蛋白與蛋白之間作用界面是突變發(fā)生的重要區(qū)域，多數(shù)腫瘤在該區(qū)域內(nèi)均有不同程度的突變[9]。Smad4的異常表達(dá)與胰腺癌等腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞的增殖能力[10]。TGF-β與HEC的生長和凋亡有關(guān)，而Smad4在增生期的HEM組織表達(dá)水平低于退化期的HEM組織，提示Smad4可能參與HEC的凋亡[6]。 本實驗結(jié)果證實了Smad4在HEM內(nèi)皮細(xì)胞凋中的作用，這與上述研究結(jié)果一致。

細(xì)胞周期可以分為細(xì)胞間期和分裂期，而間期又可以分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)，M期是細(xì)胞分裂期，G0期是細(xì)胞停止分裂，處于發(fā)揮其生物學(xué)功能階段的細(xì)胞，細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞內(nèi)周期蛋白有關(guān)，其中CDK4和Cyclin D1表達(dá)減少可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，Cyclin D1能夠與CDK4形成復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期[11]。研究[12]顯示，Smad4可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長，把細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，發(fā)揮抗腫瘤作用。Caspase參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，是一個半胱氨酸蛋白酶家族，幾乎參與所有的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其蛋白家族的成員組成一個類似瀑布的反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3是該蛋白家族的重要成員之一，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中其以沒有活性的酶原存在，而當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至Caspase反應(yīng)后，Caspase-3被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[13]。Smad4可以激活Caspase-3最終誘導(dǎo)乳腺癌、膠質(zhì)瘤等細(xì)胞凋亡[14]。ROS廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，其既可以作用一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，又可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平過度升高后，會打破細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)，對細(xì)胞造成損傷，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[15]。本實驗結(jié)果證實Smad4可以通過提高HEC中ROS水平激活Caspase凋亡反應(yīng)，通過影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)抑制HEC增殖，這可能是Smad4抗HEC生長的機(jī)制。

綜上，Smad4在HEM生長中發(fā)揮抑制作用，Smad4可能通過阻滯細(xì)胞周期抑制HEC增殖，通過促進(jìn)細(xì)胞中ROS積累激活Caspase凋亡反應(yīng)誘導(dǎo)HEC凋亡發(fā)生，這對于研究Smad4在HEM發(fā)生中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為研究HEM發(fā)生的作用機(jī)制提供了參考。本實驗存在一定的局限性，Smad4具體的靶向作用機(jī)制尚未研究，Smad4的作用機(jī)制沒有在體內(nèi)進(jìn)行驗證，后續(xù)實驗將對上述部分進(jìn)行探討。