高麗麗 吳成翰 蔡偉武

紅景天苷（salidroside）又稱薔薇紅景天苷，具有抗疲勞、抗缺氧、增強(qiáng)免疫功能及雙向調(diào)節(jié)等功效。紅景天苷是紅景天屬植物藥用價(jià)值的主要質(zhì)量指標(biāo)?！侗静菥V目》記載“紅景天苷，本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補(bǔ)諸不足”是“已知補(bǔ)益藥中所罕見”。紅景天苷在臨床已廣泛應(yīng)用，近年來眾多研究表明自噬參與腦出血后的繼發(fā)性損傷[1-2]，研究表明紅景天苷可改善創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的神經(jīng)功能，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡的作用，可降低腦外傷后的腦水腫及細(xì)胞凋亡作用[3]。紅景天苷在腦出血后還可以通過抗NF—KB的產(chǎn)生而達(dá)到降低血腦屏障的通透性，降低腦水腫[4]。本研究擬從分子生物學(xué)角度探討紅景天苷對(duì)腦出血后細(xì)胞自噬的影響，為今后腦出血的治療提供實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠120只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：S CXK（閩）2016-0002，由福建中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.2 藥品

紅景天苷（由上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：C13J8Q39713，規(guī)格：20 mg）；3-甲基腺嘌呤（3-MA）（由美國Selleck Chemicals公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：S276711，規(guī)格：50 mg）；雷帕霉素（rapa）（由美國Selleck Chemicals公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：S103911，規(guī)格：25 mg）。

1.3 試劑

Beclin 1一抗由美國Santa公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：sc-21527；LC3I一抗由英國Abcam公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：ab48394；Cathepsin D一抗由美國Santa公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：sc6486；P62一抗由美國Santa公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：sc-48431；二抗由英國Abcam公司提供，羊抗兔IgG，生產(chǎn)批號(hào)：ab175762。

1.4 儀器

手術(shù)刀、顱骨鉆、腦立體定位儀、100 μL微量注射器、微量泵（美國Rwdls公司），小型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-rad公司），多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國WEALTEC公司）。

2 方法

2.1 造模方法

大鼠腦出血模型參照Rosenberg[5]方法進(jìn)行，將大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，取頭皮正中，備皮消毒，正中切口，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取Bregma點(diǎn)（前囟）右旁開3.5 mm，后0.2 mm定點(diǎn)，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3 cm處剪斷鼠尾，用微量注射器取血50 μL，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔進(jìn)針約6 mm，將未肝素化的靜脈血50 μL以20 μL/min速度推進(jìn)尾狀核，留針約5 min，緩慢出針。留針期間酒精棉球包扎鼠尾斷端傷口，術(shù)后局部噴灑慶大霉素，用牙科水泥封閉顱骨傷口，縫合頭皮，局部皮膚采用碘酒消毒，防止局部感染。

2.2 動(dòng)物分組

將120只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組20只，具體分組如下：（1）正常對(duì)照組；（2）模型對(duì)照組；（3）假手術(shù)組：（4）紅景天苷組；（5）紅景天苷+3-MA組；（6）紅景天苷+雷帕組。

2.3 動(dòng)物給藥

（1）正常對(duì)照組：正常SD大鼠，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服生理鹽水1 mL，每日上午一次，一療程14 d；（2）模型對(duì)照組：復(fù)制腦出血SD大鼠模型，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服生理鹽水1 mL，每日上午一次，一療程14 d；（3）假手術(shù)組：正常SD大鼠，俯臥位固定大鼠，于前囟門前1 mm，正中線旁開2 mm，切開皮膚，用穿刺針鉆孔3 mm，不注入自體血，縫合皮膚。喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服生理鹽水1 mL，每日上午一次，一療程14 d；（4）紅景天苷組：復(fù)制腦出血SD大鼠模型，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服紅景天苷混懸液1 ml，每日上午一次，一療程14 d；（5）紅景天苷+3-MA組：復(fù)制腦出血SD大鼠模型，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服紅景天苷混懸液1 ml和腹腔注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（0.5 mg/kg/d，溶于含10%乙醇的生理鹽水1 ml），每日上午一次，一療程14 d；（6）紅景天苷+雷帕組：復(fù)制腦出血SD大鼠模型，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每日灌服紅景天苷混懸液1 ml和腹腔注射自噬激動(dòng)劑雷帕霉素（0.2 mg/kg/d，溶于含10%乙醇的生理鹽水1 mL），每日上午一次，一療程14 d。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

采用Bederson[6]評(píng)分法分別于造模成功后及14 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0級(jí)：無神經(jīng)功能缺損，記0分；Ⅰ級(jí)：將大鼠尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展，記1分；Ⅱ級(jí)：除Ⅰ級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較健側(cè)降低，無轉(zhuǎn)圈行為，記2分；Ⅲ級(jí)：除以上體征外，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)，記3分。

2.5 腦出血神經(jīng)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)：PBS（pH7.4）心臟灌注，小鼠斷頭，取腦，分為左右半球，取穿刺側(cè)腦組織根據(jù)蛋白免疫印跡方法檢測(cè)。超聲破碎含腦組織的lysis緩沖液，離心取上清液，進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜，5%無脂牛奶封閉，以及一抗、二抗的孵育，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶。

表1 各組大鼠造模后Bederson評(píng)分比較（分， ±s）

表1 各組大鼠造模后Bederson評(píng)分比較（分， ±s）

注：治療14 d后假手術(shù)組、紅景天苷組及紅景天苷+雷帕組與模型組比較，t值分別為2．01、1．58、1．36，P值為0．00，紅景天苷+3MA與模型組比較，t值為1．01，P值為0．01，均△P＜0．05；治療14 d后假手術(shù)組、模型組、紅景天苷+雷帕組與紅景天苷組比較，t值分別為 1．79、1．18、1．76，P值為 0．00，##P＜ 0．01。紅景天苷 +3MA 與紅景天苷組比較，t值為 1．01，P值為 0．01，#P＜ 0．05，；治療 14 d后紅景天苷+雷帕組、假手術(shù)組與紅景天+3-MA組比較，t值分別為1．23、0．96，P值均為0．00，* P＜0．05，* * P＜0．01

正常對(duì)照組2000假手術(shù)組200．26±0．020．23±0．09 △★★##模型對(duì)照組203．20±0．663．03±0．43##★★紅景天苷+3-MA組203．10±0．711．90±0．49△#紅景天苷組203．06±0．731．30±0．54 △★紅景天苷+雷帕組203．06±0．630．63±0．19 △★★##

表2 各組大鼠間自噬相關(guān)蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比較（分， ±s）

表2 各組大鼠間自噬相關(guān)蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比較（分， ±s）

注：治療14 d后模型組與正常對(duì)照組比較，t值為9．61，P值為0．03，紅景天苷+3-MA組、紅景天苷組、紅景天苷+雷帕組與正常對(duì)照組比較，t值分別為 7．23、6．98、6．13，P值為 0．01，*P＜ 0．05；B 組與 C 組比較，t值為 9．02，P值為 0．03，紅景天苷 +3-MA 組、紅景天苷組、紅景天苷+雷帕組與模型組比較，t值分別為9．35、9．02、8．11，P值均為0．01，△P＜0．05；紅景天苷+3-MA組、紅景天苷組、紅景天苷+雷帕組與假手術(shù)組比較，t值分別為7．65、7．08、6．15，P值為0．01，▲P＜0．05；紅景天苷+3-MA組與紅景天苷組比較，t值為1．05，P值為0．04，紅景天苷+雷帕組與紅景天苷組比較，t值為2．13，P值為0．02，#P＜0．05；紅景天苷+雷帕組與紅景天苷 +3-MA 組比較t值為 2．65，P值為 0．01，&P＜ 0．05

正常對(duì)照組 14 d 20 0．66±0．02△&# 0．47±0．01△&# 0．86±0．01△&# 0．48±0．01△&#假手術(shù)組 14 d 20 0．68±0．03△&# 0．47±0．05△&# 0．87±0．05△&# 0．47±0．05△&#模型對(duì)照組 14 d 20 0．48±0．03*▲#& 0．43±0．01*▲#& 0．40±0．01*▲#& 0．31±0．02*▲#&紅景天苷 +3-MA 組 14 d 20 0．29±0．02*△▲# 0．27±0．03*△▲# 0．26±0．05*△▲# 0．16±0．05*△▲#紅景天苷組 14 d 20 0．20±0．04*△▲& 0．16±0．03*△▲& 0．17±0．03*△▲& 0．15±0．01*△▲&紅景天苷 + 雷帕組 14 d 20 0．11±0．03*△▲&# 0．10±0．01*△▲&# 0．09±0．02*△▲&# 0．06±0．02*△▲&#

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠Bederson評(píng)分比較

由表1所知，造模后腦出血各組Bederson評(píng)分均較正常對(duì)照組及假手術(shù)組升高，表明腦出血大鼠造模成功；經(jīng)治療后紅景天苷干預(yù)各組Bederson評(píng)分均低于模型對(duì)照組，表明紅景天苷在腦出血后發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用，其中紅景天苷+雷帕組評(píng)分最低，紅景天苷組次之，紅景天苷+3-MA組評(píng)分最高，提示紅景天苷+雷帕組療效最佳（P＜0.01），表明紅景天苷在腦出血后的神經(jīng)功能改善作用可能與調(diào)節(jié)自噬有關(guān)。

3.2 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62比較

圖1 紅景天苷對(duì)大鼠腦出血后自噬相關(guān)蛋白的影響

如圖1和表2所示，各組治療14 d后，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組比較，紅景天苷干預(yù)各組的LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表達(dá)均下降，表明紅景天苷具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的作用，其中聯(lián)合自噬激動(dòng)劑雷帕霉素組的LC3I、Beclin 1、Cathepsin D、P62表達(dá)最低，紅景天苷組次之，紅景天苷加3-MA組表達(dá)最高，表明紅景天苷在腦出血后可激活自噬，而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，紅景天苷有抗過氧化、抗炎消菌、強(qiáng)心、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、降糖、抗輻射等作用。其還能提高血液中血紅蛋白的數(shù)量，增強(qiáng)血紅蛋白攜氧能力，提高血液中的氧含量，具有抗缺氧等作用。因其補(bǔ)益作用強(qiáng)于人參、刺五加，且沒有燥熱引起便秘等不良反應(yīng)，被譽(yù)為高原人參[7]。眾多實(shí)驗(yàn)研究表明紅景天苷在大鼠腦缺血再灌注后發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[8-9]。

自噬（autophagy）是細(xì)胞通過隔離膜包裹細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞器等物質(zhì)形成自噬體，然后將其運(yùn)送到溶酶體，再形成自噬溶酶體并進(jìn)行多種酶的消化和降解的過程。自噬在腦損傷后發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可處理受損的細(xì)胞，將細(xì)胞受損程度減到最低，避免細(xì)胞產(chǎn)生永久傷害而發(fā)揮保護(hù)作用。研究表明，自噬為腦出血后的繼發(fā)性損傷的重要途徑[10]。Beclin 1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的哺乳細(xì)胞同源基因，與早期自噬體形成有關(guān)，是其他自噬蛋白基因參與自噬形成過程的必需成分，其表達(dá)情況可體現(xiàn)自噬現(xiàn)象的發(fā)生[11-13]；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白[14-15]，有2種形態(tài)，LC3I位于細(xì)胞漿內(nèi)，LC3II位于細(xì)胞膜上，LC3II與LC3I的表達(dá)可反映細(xì)胞內(nèi)吞噬體形成的數(shù)目，是檢測(cè)自噬的重要標(biāo)志性蛋白；Cathepsin D是介導(dǎo)自噬過程的重要蛋白，研究表明其能介導(dǎo)自噬的過程，調(diào)節(jié)自噬泡的形成[16]；P62（sequestosome 1 protein，SQSTM1）是一個(gè)泛素化結(jié)合蛋白，參與自噬過程并被降解。P62在多種細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，通過自噬小體與溶酶體完成蛋白的降解[17]。當(dāng)自噬被抑制時(shí)，P62的降解減少、蛋白水平升高，而P62的增加則暗示著自噬溶酶體降解途徑被抑制[18-19]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)腦出血大鼠模型自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)提示，紅景天苷干預(yù)各組腦出血后自噬相關(guān)蛋白均較模型組降低，且其在紅景天苷加自噬激動(dòng)組的表達(dá)最低，提示紅景天苷可能參與了大鼠腦出血后的病理生理過程，在腦出血后可起到改善神經(jīng)功能的作用，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有望成為腦出血治療的新方法。