孔嵐，白玉，韓圣娜

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，鄭州 450002)

肺缺血-再灌注損傷是造成急性肺損傷的常見原因，多見于失血性休克、肺移植、體外循環(huán)手術(shù)、心臟驟停復(fù)蘇等。研究表明，肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與肺缺血-再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，有研究顯示該藥可減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷[2-3]，但機(jī)制尚不明確。筆者在本實(shí)驗(yàn)研究右美托咪定預(yù)處理對大鼠肺缺血-再灌注損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠，2個(gè)月齡，雄性，體質(zhì)量240～300 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫) 2017- 0009，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號： HG0016。 飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境，相對濕度 40%～70%，溫度20～26 ℃，人工光照，晝夜明暗交替，空氣潔凈度10 000級，落下細(xì)菌數(shù)≤每皿3個(gè)，噪聲≤60 db，自由攝食、飲水，建模前12 h禁食，本研究已獲得鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2藥品與試劑 右美托咪定(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20170702，規(guī)格：1 mL：100 μg)；丙二醛(MDA)試劑盒(批號：1508)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：1672)均購自南京建成科技有限公司；肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司，批號：H32035851，規(guī)格：2 mL：12500 U)，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 associated X protein，bax)、 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，bcl-2)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(中國碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為C1256，C1305，C1375，C1298)，二抗工作液(中國碧云天生物技術(shù)研究所，批號：SC6753，SC7876，SC8562，SC5219)。

1.3儀器與設(shè)備 HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(中國成都泰盟科技有限公司)，電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.4動(dòng)物分組與模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組(n=16)，假手術(shù)組(S組)只開左胸不夾閉肺門；缺血-再灌注(IR)組夾閉左肺門使左肺缺血45 min，再恢復(fù)灌注2 h；右美托咪定預(yù)處理+缺血-再灌注組(D組)夾閉左肺門前20 min經(jīng)股靜脈注射右美托咪定20 μg·kg-1。 參照改良的EPPINGER法[4]建立肺缺血-再灌注模型，大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，置于有保溫設(shè)備的實(shí)驗(yàn)臺上仰臥位固定，氣管切開后插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，機(jī)械通氣，潮氣量雙側(cè)肺通氣15～20 mL·kg-1，單側(cè)肺通氣8～10 mL·kg-1，通氣頻率60次·min-1，吸氣與呼氣比為1：2。維持呼氣末二氧化碳分壓(end tidal carbon dioxide tension，PETCO2)4.66～5.98 kPa，股靜脈置入24 G靜脈留置針，便于給藥和輸液。修剪左胸部皮毛，涂抹脫毛劑去毛，75%乙醇、碘酊消毒左胸部皮膚，逐步分離肌肉、筋膜，切斷肋骨后打開胸腔，暴露左肺，無損傷鉗游離左肺門，靜脈注入肝素鈉50 U，10 min后用無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門45 min，可見左肺顏色從紅色變?yōu)榘导t色，說明缺血成功，45 min后松開血管夾恢復(fù)血供，左肺由暗紫色轉(zhuǎn)為紅色，表明再灌注成功。再灌注2 h后處死大鼠，留取左肺組織。制備模型過程中使用BWZ-50C6微量泵(浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司)靜脈泵注乳酸鈉林格液6 mL·kg-1·h-1。

1.5測定大鼠肺組織濕/干重比(Wet/Dry，W/D)以及總肺含水量(total lung water，TLW) 處死大鼠，取左肺組織，用0.9%氯化鈉溶液充分漂洗，多余水分用濾紙吸干，稱重量即為濕重(W)；80 ℃恒溫箱中烘干48 h，稱干重(D)，計(jì)算肺W/D。TLW=(W-D)/D。另取部分左肺組織置于甲醛溶液，石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察、比較各組肺組織病理學(xué)特征。

1.6肺組織MDA含量和SOD活性測定 取部分左肺組織，制備10%組織勻漿，低溫離心后取上層懸液，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.7Western blotting測定bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá) 取部分肺組織，研磨為組織勻漿，高速低溫離心，取上清液，采用Bradford法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，37 ℃反應(yīng)后分別加入bax、caspase-3、bcl-2一抗和GAPDH一抗4 ℃下過夜，加入二抗室溫下反應(yīng)1.5 h?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影、定影。Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1肺組織W/D與TLW 與S組比較，其他兩組W/D升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=98.152，94.131，P<0.01)，TLW均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.172，92.386，P<0.01)；與IR組比較，D組W/D、TLW明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.163，101.231，P<0.01)。見表1。

2.2肺組織結(jié)構(gòu) S組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見明顯損傷性改變，肺泡及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無水腫，無中性粒細(xì)胞浸潤；IR組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡內(nèi)及肺泡壁充血實(shí)變，肺間隔增厚，肺泡腔和間質(zhì)嚴(yán)重水腫，并可見大量紅細(xì)胞漏出，中性粒細(xì)胞明顯浸潤。D組肺組織損傷程度明顯減輕，肺泡及肺間質(zhì)僅少量中性粒細(xì)胞浸潤。

表13組肺組織W/D與TLW測定結(jié)果

組別大鼠數(shù)W/DTLWS組164.31±0.283.29±0.26IR組165.99 ±0.41*14.71±0.39*1D組165.30±0.12*1*24.23±0.21*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.3肺組織MDA含量及SOD活性比較 與S組比較，其他兩組肺組織MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=91.769，95.832，P<0.01)；SOD活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.335，97.356，P<0.01)；與IR組比較，D組肺組織MDA含量降低(F=95.534，P<0.01)，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.769，P<0.01)，見表2。

表23組大鼠肺組織MDA含量與SOD活性測定結(jié)果

組別大鼠數(shù)MDA/(nmol·mg-1)SOD/(U·mg-1)S組160.372±0.019 112±5 IR組160.671±0.036*1 61±6*1D組160.536±0.059*1*2 75±8*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.4肺組織bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá)比較 與S組比較，其他兩組肺組織bax蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.535，99.765，P<0.01)，caspase-3蛋白表達(dá)升高(F=103.325，95.126，P<0.01)，bcl-2蛋白表達(dá)降低(F=98.635，95.396，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IR組比較，D組肺組織bax、caspase-3蛋白表達(dá)降低(F=97.215，94.156，P<0.01)，bcl-2蛋白表達(dá)升高(F=106.235，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3 討論

肺缺血-再灌注損傷是臨床常見問題，也是急性肺損傷的主要原因之一。預(yù)防和減輕肺缺血-再灌注損傷一直是臨床研究熱點(diǎn)。右美托咪定是一種高選擇性α2-腎上腺素受體激動(dòng)藥，目前已發(fā)現(xiàn)其對缺血-再灌注所引起的臟器損傷具有良好的保護(hù)作用，機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥細(xì)胞因子釋放以及抗細(xì)胞凋亡等有關(guān)[5-6]。目前臨床圍術(shù)期右美托咪定多預(yù)先給藥，因此本研究亦采用右美托咪定預(yù)處理方式，以更接近臨床實(shí)踐。筆者根據(jù)相關(guān)報(bào)道選取右美托咪定濃度[7]，即于缺血前20 min給予右美托咪定20 μg·kg-1。筆者在本研究采用改良EPPINGER[4]法建立大鼠肺缺血-再灌注模型，結(jié)果顯示，IR組肺組織W/D、TLW均升高，肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯損傷性改變，提示大鼠肺缺血-再灌注損傷模型制備成功。D組肺組織病理損傷明顯輕于IR組，提示右美托咪定能減輕肺組織損傷。

表33組大鼠肺組織bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá)情況

組別大鼠數(shù)baxcaspase-3bcl-2S組1698.76±12.3799.98±13.1699.85±11.02IR組16234.12±26.35*1197.75±21.08*138.67±5.18*1D組16172.23±16.87*1*2143.79±14.25*1*268.91±7.76*1*2

與S組比較，*1P<0.01；與IR組比較，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

組織器官發(fā)生缺血-再灌注時(shí)，體內(nèi)氧自由基生成增多，膜磷脂中多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量有毒脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，造成并加重組織損傷[8-11]。SOD是體內(nèi)最主要的抗氧化酶和自由基清除劑，可以將脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA等)歧化為過氧化氫和水，清除氧自由基并終止自由基病理性連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力[12]。MDA含量可直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[13]。本研究中，與S組比較，IR組肺組織MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，說明大鼠肺缺血-再灌注損傷過程有氧化應(yīng)激反應(yīng)參與；D組肺組織MDA含量明顯較IR組降低，SOD活性明顯較IR組升高，提示右美托咪定可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷。

研究表明，在IR損傷中，細(xì)胞凋亡是再灌注后炎性反應(yīng)和組織損傷的重要因素[14]。因此細(xì)胞凋亡在肺缺血-再灌注損傷中具有重要作用[15]。bcl-2和bax對調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡非常重要，bcl-2使細(xì)胞色素C釋放減少，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，bcl-2介導(dǎo)的抑制凋亡作用能被bax所拮抗，兩者處于平衡狀態(tài)。缺血-再灌注會影響細(xì)胞中這種平衡，導(dǎo)致細(xì)胞色素C大量釋放進(jìn)入胞質(zhì)，引起細(xì)胞caspase凋亡途徑被激活，發(fā)生細(xì)胞凋亡、組織功能損傷[16]。本研究中，與S組比較，IR組大鼠肺組織bax、caspase-3表達(dá)量升高明顯，bcl-2表達(dá)降低明顯，提示缺血-再灌注可造成肺組織細(xì)胞過度凋亡。D組大鼠肺組織bax、caspase-3表達(dá)量明顯較IR組低，bcl-2表達(dá)量明顯較IR組高。提示右美托咪定可以抑制細(xì)胞凋亡。

總之，右美托咪定可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡來減輕大鼠肺缺血-再灌注損傷。