司昕蕾，蔡秀榮，曹瑞，邊甜甜，辛二旦，牛江濤，張愛霞，李越峰*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 734000

花椒為蕓香科植物青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc或花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim的干燥成熟果皮[1]?；ń返南銡獬煞謥碜杂谄浣M織中所含的揮發(fā)油，其揮發(fā)油是由萜烯等有機(jī)化合物及其含氧衍生物醇、醛、酮、酯等成分組成，是一種揮發(fā)性的油狀物質(zhì)[2]。甘肅省隴南市武都區(qū)是中國名特優(yōu)經(jīng)濟(jì)林花椒之鄉(xiāng)，其所產(chǎn)的花椒具有粒大飽滿、麻味醇厚、藥效成份多、揮發(fā)油含量高等特點(diǎn)[3]。檸檬烯、芳樟醇在花椒中含量較高，是花椒的特征性成分[4]，測(cè)定甘肅隴南大紅袍花椒揮發(fā)油中檸檬烯、芳樟醇可有效的控制其質(zhì)量。近年來GC-MS技術(shù)經(jīng)常用于揮發(fā)油、揮發(fā)性成分定量及鑒定研究[5-7]，遂本文采用GC-MS測(cè)定及鑒定甘肅隴南大紅袍花椒揮發(fā)油中檸檬烯、芳樟醇。

1 材料

1.1 儀器及設(shè)備

HY-04 型高速粉碎機(jī)(上海菲力博寶業(yè)公司 型號(hào)：LFP-500A)；萬分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司 型號(hào)：AL104)；HH-S 型恒溫水浴鍋(余姚市檢測(cè)儀表廠)；7890A-5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器，HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，MSD化學(xué)工作站，NIST1譜庫，GC-MS數(shù)據(jù)分析工作站。棕色容量瓶，玻璃棒，離心管，移液管，移液槍；一次性使用無菌注射器(湖北康友醫(yī)用器材有限公司 規(guī)格：1 mL)；0.45 μm微孔濾膜。

1.2 試劑

正己烷(色譜純 天津市大茂化學(xué)試劑廠)，哇哈哈純凈水。

1.3 對(duì)照品

檸檬烯(20 mg，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院 批號(hào)：180109)；芳樟醇(20 mg，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院 批號(hào)：170912)。

1.4 藥材

隴南大紅袍花椒，采購自甘肅省隴南市，藥材經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王明偉教授鑒定符合2015版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)定。

樣品預(yù)處理：樣品粉碎過30目篩。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品母液制備 分別精密稱取檸檬烯和芳樟醇20.00 mg，分別置于5.0 mL容量瓶中，用正己烷定容，得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[8]。

2.1.2 供試品溶液制備 采用水蒸氣蒸餾法，分別稱取花椒粉末20.00 g，于1000 mL的具塞錐形瓶中，加入10倍量的水與沸石數(shù)粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流人燒瓶時(shí)為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸約5小時(shí)，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端的活塞，將揮發(fā)油緩緩放出。取揮發(fā)油30 μL加正己烷定容至10 mL，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品[9]。

2.2 進(jìn)樣條件

2.2.1 色譜條件 HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣為氮?dú)猓d氣流量為1.0 mL·min-1。程序升溫，起始溫度60 ℃，保持2 min，以3 ℃·min-1升溫至165 ℃，然后以20 ℃·min-1升溫至280 ℃，保持5 min。進(jìn)樣量1μL，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；汽化室溫度為250 ℃[10]。

2.2.2 質(zhì)譜條件 EI 離子源，電壓70 eV，溫度230 ℃；四級(jí)桿質(zhì)量監(jiān)測(cè)器，溫度150 ℃；掃描范圍m/z：40～500 amu；溶劑延遲4 min。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品母液加正己烷稀釋，得到檸檬烯的濃度系列為：0.16、0.24、0.32、0.48、0.56、0.64、0.8 mg·mL-1，芳樟醇的濃度系列為：0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.80、0.96 mg·mL-1；按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得檸檬烯、芳樟醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 樣品含量測(cè)定 按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定供試品溶液，在上述色譜條件下分析，用面積外標(biāo)法計(jì)算花椒中檸檬烯、芳樟醇的含量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)隴南大紅袍花椒粉末6份，按“供試品溶液的制備”方法，對(duì)樣品分別制備12份供試品溶液，分別在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定乙酸芳樟酯的含量。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取0.7 mg·mL-1的對(duì)照品溶液0.2 μL在0、2、4、6、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定乙酸芳樟酯的含量。

2.5 成分鑒定

將制備所得提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾之后，用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣1 μL。經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索(質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NTST)，鑒定隴南大紅袍花椒揮發(fā)油成分。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果表明，檸檬烯進(jìn)樣濃度在0.16～0.80 mg·mL-1時(shí)，響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，響應(yīng)值與濃度的回歸方程為Y= 5×108X-2×107，相關(guān)系數(shù)為r= 0.999 8；芳樟醇在0.32～0.96 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，響應(yīng)值與濃度的回歸方程為：Y= 4×108X-5×108相關(guān)系數(shù)為r=0.999 5。

3.2 樣品含量測(cè)定

圖1 甘肅隴南大紅袍花椒揮發(fā)油氣相色圖譜

圖2 檸檬烯氣相色譜圖

圖3 芳樟醇?xì)庀嗌V圖

Group檸檬烯芳樟醇Sample 10.35 0.95 Sample 20.37 1.03 Sample 30.36 0.97 Sample 40.41 1.14 Sample 50.39 0.89 Sample 60.33 1.39 Sample 70.40 1.23 Sample 80.42 1.29 Sample 90.32 0.87 Sample 100.44 0.89 Sample 110.34 1.21 Sample 120.32 0.95

取12批甘肅隴南大紅袍花椒經(jīng)粉碎過篩后，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定檸檬烯、芳樟醇的含量。結(jié)果表明甘肅隴南大紅袍花椒中芳樟醇含量(1.07%±0.16%)略高于檸檬烯含量(0.37%±0.04%)。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得甘肅隴南大紅袍花椒中芳樟醇含量均值為1.03%，RSD為0.08%；檸檬烯含量均值為0.37%，RSD為0.03%結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果芳樟醇含量的RSD=0.79%，檸檬烯含量的RSD=0.81%，穩(wěn)定性良好。

3.4 成分鑒定

圖4 檸檬烯質(zhì)譜圖

圖5 芳樟醇質(zhì)譜圖

經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索(質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NTST)，鑒定隴南大紅袍花椒揮發(fā)油成分為檸檬烯、芳樟醇。

4 結(jié)論

根據(jù)隴南大紅袍花椒揮發(fā)油成分為檸檬烯、芳樟醇的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其芳樟醇含量略高于檸檬烯，且芳樟醇、檸檬烯含量較高，可以用來快速、簡(jiǎn)便控制其花椒質(zhì)量?；ń窊]發(fā)油用正己烷稀釋較甲醇、乙醇稀釋效果好，其測(cè)定峰在此條件下分離度、峰形好。芳樟醇是花椒中重要的香氣成分之一，具有抗菌、鎮(zhèn)靜、除臭、殺蟲等功效，檸檬烯含量青花椒中為0.013%，紅花椒中為0.014%；芳樟醇的含量在青花椒中為0.072%，紅花椒中為0.008%[11]，從這兩個(gè)指標(biāo)來看，隴南大紅袍花椒中的檸檬烯、芳樟醇含量均高于紅花椒和青花椒，這可能是引起隴南大紅袍花椒與青花椒、紅花椒香味差異的重要原因。