王 萍，于月華，白玉翠，郭坤鵬，康嘉楠，倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)是重要的食用蛋白、食用油和飼用蛋白原料，也是我國主要的糧食作物之一。近年來我國大豆的消費增長迅速，主要集中在食用大豆、大豆油、飼用豆粕等方面，且年消費量分別為800，900，3 000多萬t。其中大豆油消費量占植物油總消費量的40%以上，飼用豆粕消費量約占國內(nèi)飼料工業(yè)蛋白原料的60%，是肉、蛋、奶中蛋白質(zhì)的間接來源[1]。為了培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的大豆品種來提高大豆的品質(zhì)及產(chǎn)量，深入了解大豆發(fā)育和抗逆的分子機制對于該作物產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳改良有重要意義。

目前，已知幾種類型的轉(zhuǎn)錄因子，如NAC、WRKY、AP2/EREBP、C2H2、MYB等[2-4]，它們對植物在非生物脅迫中所受的壓力有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。NAC蛋白家族是一個大型植物特異性家族，在大多數(shù)植物中具有100～170個成員[5]，其特征在于在N末端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域和高度不同的轉(zhuǎn)錄激活因子C末端[6]。Souer等[7]于1996年首次在矮牽牛(Petuniahybrida)中克隆出了NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NAM(NoApicalMeristem)。緊接著Aida等[8]也在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)了ATAF1/2和CUC2(cup-shapedcotyledon)轉(zhuǎn)錄因子基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)該基因與NAM結(jié)構(gòu)相似。近年來,研究者們發(fā)現(xiàn)了許多NAC轉(zhuǎn)錄因子，且該類轉(zhuǎn)錄因子具有多種多樣的生物功能和植物特異性。目前，已在擬南芥、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)等約20多種植物中發(fā)現(xiàn)了NAC基因。因此，NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子是目前在植物基因組中發(fā)現(xiàn)的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[9]。

如今，在研究者們對大豆NAC基因家族不斷深入的研究下,克隆并鑒定了許多大豆NAC類轉(zhuǎn)錄因子基因。該家族中許多成員還參與植物非生物和生物脅迫應(yīng)答，同時也在植物適應(yīng)外界不良環(huán)境過程中發(fā)揮著重要作用，表達譜分析結(jié)果表明，約20%～25%的NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了至少一種非生物脅迫應(yīng)答過程[10]，它們在植物生長發(fā)育[11-12]、激素調(diào)節(jié)和抵御逆境[13-14]等方面發(fā)揮著重要的作用。例如，Jin等[15]、Quach等[16]研究發(fā)現(xiàn)，過表達的GmNAC2基因和過表達的GmNAC004基因分別會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草對干旱、鹽和低溫敏感并增加擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)量和長度，并且轉(zhuǎn)GmNAC004的擬南芥和野生型擬南芥相比在中度水分脅迫條件下，其側(cè)根數(shù)和長度都比野生型高。金杭霞[17]發(fā)現(xiàn)，過量表達GmNAC5基因使轉(zhuǎn)基因煙草葉片形態(tài)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致煙草葉片變狹長，GmNAC2基因過量表達使煙草對干旱、高鹽和冷害脅迫表現(xiàn)較敏感，煙草幼苗出現(xiàn)矮小，根長較短等現(xiàn)象。劉曉慶等[18]通過對GmNAC8做Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，GmNAC8與相應(yīng)的抗體有良好的結(jié)合能力，具有特異性。Souer等[7]研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛的NAM基因突變體不能正常形成頂端分生組織，此結(jié)果說明NAC基因在分生組織的生長發(fā)育中起重要作用。韓巧玲等[19]研究表明，GmNAC2a基因可能作為交叉點,不僅參與非生物脅迫響應(yīng)途徑,而且可能參與乙烯相關(guān)的生物響應(yīng)途徑。Ni等[20]研究分析了大豆gma-MIR394a基因的功能，發(fā)現(xiàn)gma-MIR394a基因在干旱脅迫忍耐中具有正調(diào)控功能。劉輝等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SlNAC80的表達受低溫、干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，表明SlNAC80可能通過ABA依賴的途徑參與番茄非生物脅迫應(yīng)答。王國東等[22]發(fā)現(xiàn)，PnNAC1響應(yīng)幾種逆境相關(guān)信號分子，并參與三七對茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢的防衛(wèi)反應(yīng)。這些研究表明，NAC是一類具有多種生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子。

大豆基因組由152個編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因組成[23]，目前，已經(jīng)有許多大豆NAC基因被克隆和分析，同時也鑒定出了一些大豆NAC基因的功能。這些研究對深入探索大豆的生長發(fā)育情況及其對逆境脅迫響應(yīng)的分子機制有著非常重要的意義。本研究從大豆中克隆了1個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為GmNAC23，并對其進行了系統(tǒng)進化樹、組織特異性表達模式及轉(zhuǎn)錄激活功能分析，旨在為進一步研究該基因的生物學(xué)功能奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大豆栽培品種為Williams 82，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物種質(zhì)資源中心抗逆研究課題組所提供。將其在溫室中水培25 d后，取葉片組織，液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱備用；DL2000 Marker購自北京天根生化公司；TaqDNA聚合酶、大腸桿菌菌株(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞購于北京全式金生物有限公司；卡那霉素(Kan)、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamH Ⅰ、T4DNA連接酶購于Fermentas公司；引物合成于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母 YPDA 培養(yǎng)基粉末、酵母單缺培養(yǎng)基粉末SD(Trp-)、酵母三缺培養(yǎng)基粉末SD(Trp-/His-/Ade-)購于北京泛基諾生物有限公司；ONPG購于北京全式金生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆葉片RNA的提取與cDNA的合成 將保存于-80 ℃冰箱的大豆葉片經(jīng)液氮研磨后，使用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取葉片組織總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA，電泳檢測成功后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher)的說明書，將提取的大豆葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2GmNAC23基因全長序列的獲得及克隆 本試驗根據(jù)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.phytozome.net/soybean.php)中大豆基因組數(shù)據(jù)的Glyma05g00930.1基因序列，設(shè)計了1對引物，nGmNAC23-F: 5′-CAA TAAAGAGTTTTGTTGAAATGGAA-3′和nGmNAC23-R: 5′-ACTTTTAGTAATTCCACAAACCATCA-3′，以合成的大豆葉片cDNA為模板，采用PCR的方法擴增GmNAC23基因的開放閱讀框(ORF)。PCR程序為:94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72 ℃ 1 min( 35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。將擴增后的PCR產(chǎn)物置1%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外凝膠成像儀(Bio-Rad)觀察結(jié)果。檢測合格后將純化的PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pJET1.2 (Thermo Fisher)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑選陽性克隆送上海美季公司測序。

1.2.3GmNAC23序列的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對GmNAC23序列進行分析，從GenBank上下載其他物種的氨基酸序列進行同源性分析，用DNAMAN軟件進行多重序列比較，選取其他NAC基因的不同物種，如綠豆、鷹嘴豆、木豆、蒺藜苜蓿、木薯的NAC類基因，用MEGA 4.1軟件構(gòu)建這些物種的系統(tǒng)發(fā)生樹。用Protparam(http://www. expasy.org/tools/protparam)在線工具，分析預(yù)測GmNAC23蛋白的分子質(zhì)量、等電點及其理化性質(zhì)；利用Predictprotein(https://open.predictprotein.org/)對氨基酸的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用ExPASy(http://web. expasy．org/)對氨基酸的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用 Phytozome V 10.3在線數(shù)據(jù)庫對GmNAC23基因的組織特異性表達模式進行分析，并發(fā)現(xiàn)了GmNAC23基因在染色體上的定位。

圖1 大豆GmNAC23蛋白與其他植物NAC蛋白的同源性比對(A)及其結(jié)構(gòu)域預(yù)測(B)Fig.1 Homology comparison of soybean GmNAC23 protein with other plant NAC proteins (A) and its domain prediction (B)

1.2.4GmNAC23酵母表達載體的構(gòu)建 根據(jù)大豆GmNAC23基因序列，設(shè)計帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的引物用PCR方法擴增GmNAC23的ORF序列，引物序列為，23-F: 5′-ATTGAATTCATGGAA AACGTTCCGGCGGTG-3′和23-R: 5′-TTAGGATCCTTAGTAATTCCACAAACCATCAAGATCCAATG-3′，(引物中劃線部分表示酶切位點)。膠回收帶有酶切位點GmNAC23的ORF序列，經(jīng)過雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行純化后，與相同酶切的pGBKT7載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，通過菌液PCR和測序(上海美季)對重組質(zhì)粒進行檢測。

1.2.5 GmNAC23轉(zhuǎn)錄激活活性分析 酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活試驗參照Yu等[24]方法。利用ONPG方法測定酵母菌株AH109中不同轉(zhuǎn)化體β-半乳糖苷酶活性，參照李葉云等[25]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNAC23基因的克隆及序列分析

本研究以大豆葉片cDNA為模板，利用RT-PCR的方法獲得了一段長為1 077 bp的核苷酸序列，并將其命名為GmNAC23。GmNAC23編碼區(qū)長1 053 bp，編碼350個氨基酸，通過軟件預(yù)測其分子量為39.483 ku，等電點為7.08。GmNAC23基因組DNA由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，長度為 1 778 bp。預(yù)測氨基酸序列如圖1，發(fā)現(xiàn)GmNAC23中含有1個NAM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于第16-166個氨基酸，并且在GmNAC23的第188-202個氨基酸存在1個低復(fù)雜組成區(qū)域，此區(qū)域由LGSSALPPLSDSSPS氨基酸組成(圖1)。

將利用NCBI搜索得到的綠豆、鷹嘴豆、木豆、蒺藜苜蓿、木薯的氨基酸序列與GmNAC23的氨基酸序列進行多序列比對并作系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)GmNAC23與綠豆VrNAC(Vignaradiata，XP_ 014507026)和木豆CaNAC(Cajanuscajan，XP_020227105)的親緣關(guān)系較近，氨基酸一致性分別為88%和84%，且GmNAC23與木豆CaNAC聚在一個分支(圖2)。

2.2 GmNAC23蛋白質(zhì)序列分析

利用蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測網(wǎng)站 (http://www.psort.org/)對GmNAC23的亞細胞定位進行預(yù)測分析, 結(jié)果顯示, GmNAC23與其轉(zhuǎn)錄因子的特征一致定位于細胞核中第5號染色體Chr05:2217936..2219956(reverse)上。利用在線軟件(https://open.predictprotein.org/)預(yù)測GmNAC23蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(圖3)。通過SWISS-Model(http://swissmodel.expasy.org/)對GmNAC23蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，得到了該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2 GmNAC23蛋白與其他NAC蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of GmNAC23 protein and other NAC protein systems

圖3 大豆GmNAC23蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Secondary structure prediction of soybean GmNAC23 protein

圖4 大豆GmNAC23蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of soybean GmNAC23 protein

2.3 GmNAC23基因的組織特異性表達分析

本研究為了探索GmNAC23基因的組織特異性表達情況，利用Phytozome V 10.3數(shù)據(jù)庫搜索獲得了GmNAC23基因在大豆不同組織中的組織特異性表達數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大豆的不同組織中GmNAC23基因均有表達，并且表達量存在差異。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的FPKM值，發(fā)現(xiàn)GmNAC23基因在根中表達量最多，達到67.492。GmNAC23基因在莖頂端分生組織中表達量最小，為0.230(表1)。以上結(jié)果表明，在大豆不同組織的發(fā)育過程中均有GmNAC23基因的參與，且GmNAC23基因?qū)Υ蠖共煌M織的生長發(fā)育起到一定的調(diào)控作用。

2.4 GmNAC23的轉(zhuǎn)錄激活功能分析

將擴增得到的GmNAC23與pGBKT7連接構(gòu)建酵母表達載體，轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，pGBKT7 空載體作為對照同時轉(zhuǎn)化酵母菌株, 將稀釋過的菌液分別點在單缺和三缺的平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d。觀察酵母菌落的生長情況，其結(jié)果是轉(zhuǎn)化體pGBKT7和GmNAC23-pGBKT7在酵母單缺SD(Trp-)營養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基上均能正常生長，說明這2個質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)化到酵母中。而轉(zhuǎn)化GmNAC23-pGBKT7的酵母轉(zhuǎn)化體能在三缺SD (Trp-/His-/Ade-)營養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基上正常生長，對照pGBKT7的酵母轉(zhuǎn)化體不能在三缺SD (Trp-/His-/Ade-)營養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基上正常生長。以上試驗結(jié)果說明，GmNAC23具有一定的轉(zhuǎn)錄激活功能，并且其轉(zhuǎn)錄激活功能較強(圖5-A)。

表1 大豆GmNAC23基因的組織特異性表達Tab.1 Tissue-specific expression of soybean GmNAC23 gene

A.GmNAC23在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活功能分析； B.GmNAC23轉(zhuǎn)錄因子β-半乳糖苷酶活性分析。A.Analysis of transcriptional activation function of GmNAC23 in yeast; B.Analysis of β-galactosidase activity of GmNAC23 transcription factor.

對GmNAC23的轉(zhuǎn)錄激活功能進行了定性分析后，本研究進一步對pGBKT7和GmNAC23-pGBKT7的轉(zhuǎn)錄激活活性進行了定量分析，分析了酵母菌株AH109中pGBKT7和GmNAC23-pGBKT7轉(zhuǎn)化體β-半乳糖苷酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmNAC23-pGBKT7轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出較高的β-半乳糖苷酶活性，而對照pGBKT7轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出較低的β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果進一步說明GmNAC23轉(zhuǎn)錄因子具有較強的轉(zhuǎn)錄激活功能(圖5-B)。

3 結(jié)論與討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是參與植物的許多調(diào)控和發(fā)育過程以及植物應(yīng)激反應(yīng)的一類轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)成了一個大的植物特異性家族，由N端保守的DNA結(jié)合區(qū)域和C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域組成的，NAC也是植物特有的一個轉(zhuǎn)錄因子家族。鄒嘉欣等[26]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NAC家族基因分布廣，結(jié)構(gòu)多為個3個外顯子，1個擁有兩端保守基序的NAM結(jié)構(gòu)域位于2個相鄰?fù)怙@子上。本研究從大豆中克隆得到了1個命名為GmNAC23的NAC轉(zhuǎn)錄因子，其具有1個NAM保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域位于第16-166個氨基酸。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，GmNAC23轉(zhuǎn)錄因子具有3個外顯子和2個內(nèi)含子，Meng等[27]研究發(fā)現(xiàn)，GmNAC1-GmNAC6都含有2個內(nèi)含子，表明這些GmNAC具有保守的基因組結(jié)構(gòu)。

NAC蛋白構(gòu)成一個大的家族，其每個家族成員在植物發(fā)育中扮演不同的角色，NAC轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆诰幋a植物中重要調(diào)節(jié)蛋白的大家族基因。李偉等[28]通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，19個生物學(xué)功能已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子在同一分支的具有相似的生物學(xué)功能。本研究通過對NCBI搜索得到的綠豆、鷹嘴豆、木豆、蒺藜苜蓿、木薯的氨基酸序列與GmNAC23的氨基酸序列進行多序列比對并作系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)綠豆(88%)和木豆(84%)與其進化關(guān)系最近，氨基酸一致性達到88%和84%，并且其具有相似的生物學(xué)功能。

前人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，許多大豆NAC家族成員基因具有轉(zhuǎn)錄激活的功能。Tran等[29]對31個GmNAC轉(zhuǎn)錄因子進行酵母單雜實驗，發(fā)現(xiàn)其中28個都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。這些研究說明大豆NAC家族蛋白可能具有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。本研究預(yù)測GmNAC23亞細胞定位發(fā)現(xiàn)其定位于細胞核中第5號染色體上，并對GmNAC23的轉(zhuǎn)錄激活功能進行了定性和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmNAC23具有較強的轉(zhuǎn)錄激活功能。這與NAC蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性的傳統(tǒng)認知相符合[30-32]。以上研究結(jié)果為下一步分析轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的定位提供了依據(jù)。

大豆基因組中含有 152 個編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因，這些NAC基因呈現(xiàn)的表達模式各不相同。孟慶長[33]從大豆中克隆了6個編碼NAC同源蛋白的基因序列GmNAC1～GmNAC6，組織表達分析表明GmNAC4和GmNAC6為組成性表達。其他4個基因的表達具有不同的表達模式。本研究利用在線軟件探索GmNAC23基因的組織特異性表達情況，發(fā)現(xiàn)在大豆不同組織的發(fā)育過程中均有GmNAC23基因的參與，且GmNAC23基因?qū)Υ蠖共煌M織的生長發(fā)育起到一定的調(diào)控作用。

本研究利用RT-PCR的方法從大豆中克隆1個NAC基因GmNAC23。序列分析表明，GmNAC23基因組包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。多序列比對結(jié)果表明，GmNAC23蛋白含有1個高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄活性分析結(jié)果表明，GmNAC23具有轉(zhuǎn)錄激活功能。組織特異性表達模式分析表明，在檢測的所有組織中GmNAC23都有表達，在根中表達量最高，在莖頂端分生組織中表達量最低。本研究為進一步分析大豆GmNAC23的生物學(xué)功能提供實驗基礎(chǔ)。