宋之波，侯引緒，郭江鵬

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261000；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；3.北京市畜牧總站，北京 100101 )

奶牛結(jié)核病是一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，該病嚴(yán)重威脅食品安全和人體健康，嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易，被《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》列為二類動(dòng)物傳染病。1949年以來(lái)，我國(guó)對(duì)該病采取了一系列嚴(yán)格有效的檢疫、凈化、防控措施，獲得了良好效果。目前，該病已成為我國(guó)所有奶牛場(chǎng)必須檢測(cè)、凈化的一種疫病。

隨著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；膛?chǎng)的養(yǎng)殖數(shù)量和存欄量迅速增加，100頭以上規(guī)模牛場(chǎng)已經(jīng)成為奶牛養(yǎng)殖的主體，萬(wàn)頭牛場(chǎng)也不在少數(shù)。在這種情況下，牛場(chǎng)的牛結(jié)核病檢測(cè)工作壓力正逐步加大，尤其是大型牛場(chǎng)、萬(wàn)頭牛場(chǎng)，一年兩次例行的檢疫、凈化，工作量甚巨。因此，牛場(chǎng)迫切需要更快捷、更準(zhǔn)確、適用不同規(guī)模的牛結(jié)核檢測(cè)方法，以簡(jiǎn)化程序、提高檢測(cè)質(zhì)量、提高效率。

本研究采用PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法、牛結(jié)核病PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)方法、γ-干擾素ELISA方法在規(guī)模牛場(chǎng)進(jìn)行了牛結(jié)核病檢測(cè)，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析，以供參考。

1 材料

1．1 試劑

牛型提純結(jié)核菌素（PPD），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；γ-干擾素ELISA試劑檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)時(shí)間為2017年10月至2018年6月，先后在北京市規(guī)?；膛?chǎng)及華北某大型奶牛場(chǎng)，隨機(jī)選擇1～4胎的荷斯坦成乳牛（不包括分娩0～4周的奶牛）為試驗(yàn)牛，共計(jì)8 000頭，結(jié)合春秋季牛場(chǎng)結(jié)核檢疫工作同時(shí)進(jìn)行。

1．3 試驗(yàn)分組

在8 000頭試驗(yàn)牛中隨機(jī)選擇6 000頭，用PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)；其余2 000頭用牛結(jié)核病PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)；再對(duì)PPD皮內(nèi)反應(yīng)檢出的陽(yáng)性反應(yīng)牛、可疑牛和在頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)組隨機(jī)選擇的陰性牛2 000頭，用γ-干擾素ELISA方法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

2 試驗(yàn)方法

2．1 PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)方法

2.1.1 結(jié)核菌素稀釋及用量

將牛型提純結(jié)核菌素凍干制品用注射用水（或生理鹽水）稀釋至10萬(wàn)IU/mL，每頭牛皮內(nèi)注射0.1mL。

2.1.2 檢測(cè)部位及處理

PPD注射及檢測(cè)部位為牛頸中上部，具體部位見(jiàn)圖1。檢疫部位提前1天除毛（剃毛用剃頭刀或電動(dòng)剃毛具），除毛范圍直徑一般為10cm。

圖1 牛結(jié)核檢疫頸部位置

2.1.3 測(cè)皮厚

除毛后將皮膚捏提成一雙層皺褶，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮厚，并做好記錄。

2.1.4 牛提純結(jié)核菌素（PPD）注射及皮厚測(cè)量

用酒精棉球?qū)ψ⑸洳课贿M(jìn)行擦拭后，一律皮內(nèi)注射0.1mL牛提純結(jié)核菌素，注射部位鼓起一小包表明注射成功。如果在注射過(guò)程中出現(xiàn)“打飛針”問(wèn)題，需重新補(bǔ)注1次。

皮內(nèi)注射后72h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮厚，并觀察結(jié)果；注射前后的皮厚測(cè)量由同一人完成。

2.1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

注射部位出現(xiàn)明顯的紅、腫者判定為陽(yáng)性（+）；注射部位2次皮厚差大于4mm者判定為陽(yáng)性（+）；注射部位2次皮厚差在2.1～3.9mm間者判定為可疑（±）；注射部位無(wú)任何反應(yīng)或皮厚差在2mm以下為陰性（-）。

2．2 PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法

2.2.1 檢測(cè)部位及方法

選擇牛尾根腹面中線（或中褶）左側(cè)或右側(cè)尾腹面皮膚處作為注射檢測(cè)部位，用酒精棉球消毒注射點(diǎn)。一手捏起尾根部中褶皮膚，將注射器針頭刺入一側(cè)皮膚皮內(nèi)，注入0.1mL10萬(wàn)IU/mL的提純結(jié)核菌素，皮膚內(nèi)形成豌豆大小的凸起，表明注射成功。

2.2.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

注射72h后進(jìn)行結(jié)果判定。在注射部位出現(xiàn)觸診或明顯可視的腫脹變化，或尾中褶厚度≥8mm，或尾褶厚度與對(duì)側(cè)比較厚度差≥4mm， 則判定為陽(yáng)性（+）。

尾褶厚度與對(duì)側(cè)比較，厚度差在2.1～3.9mm判定為可疑（±） 。

尾褶厚度與對(duì)側(cè)比較，厚度差小于2mm者判定為陰性（-）。

2．3 γ-干擾素ELISA方法

2.3.1 檢測(cè)方法

試劑配制、材料選擇及檢測(cè)步驟全部按γ-干擾素ELISA試劑盒說(shuō)明書上的要求和操作注意事項(xiàng)執(zhí)行。

2.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

只有當(dāng)結(jié)果滿足陽(yáng)性對(duì)照OD值＞0.700、陰性對(duì)照OD值＜0.150條件時(shí)試驗(yàn)有效；

陽(yáng)性：牛PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1；

陰性：牛PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1；

重復(fù)孔OD值的計(jì)算需取平均值。

3 結(jié)果與分析

3．1 PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果為：陰性5 972頭，占99.53%，陽(yáng)性21頭占0.35%，可疑7頭，占0.12%。

表1 PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)果

3．2 PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果

由表2可知，PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果：陰性1 990頭，占99.50%，陽(yáng)性8頭，占0.40%，可疑5頭，占0.10%。

表2 PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果

3．3 γ-干擾素EISA方法牛結(jié)核病檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，PPD頸部皮內(nèi)檢測(cè)組隨機(jī)選出的2 000頭陰性牛用γ-干擾素ELISA方法檢測(cè)的結(jié)果為：陰性1 895頭，占99.45%，陽(yáng)性9頭，占0.40%，可疑2頭，占0.10%。

由表4可知，利用γ-干擾素ELISA方法重復(fù)檢測(cè)PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性、可疑牛，結(jié)果為陽(yáng)性24頭，可疑4頭。其中PPD頸部法的7頭可疑牛有3頭轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。

表3 γ-干擾素ELISA方法牛結(jié)核病檢測(cè)結(jié)果

表4 利用 γ-干擾素ELISA方法對(duì)PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性、可疑牛重復(fù)檢測(cè)結(jié)果

4 討論

本試驗(yàn)所選擇的奶牛主要來(lái)源于大型規(guī)模化奶牛場(chǎng)，用PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法、PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法、γ-干擾素ELISA方法檢測(cè)所得的平均陽(yáng)性率為0.40%，可疑的比例為0.11%，說(shuō)明我國(guó)大型規(guī)?；膛?chǎng)在結(jié)核病的防控和凈化工作上取得了較好效果[1]。

在群體陰性牛比例、陽(yáng)性牛比例、可疑牛比例指標(biāo)上，PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果與尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果基本一致，均可以反映群體結(jié)核感染率。PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法測(cè)定結(jié)果與γ-干擾素ELISA方法檢測(cè)結(jié)果差異也不大；對(duì)于陽(yáng)性牛的檢測(cè)，γ-干擾素ELISA方法重復(fù)檢測(cè)結(jié)果與PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)果一致；但對(duì)于PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果為可疑的7頭牛的復(fù)檢，其中3頭的γ-干擾素ELISA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。這從一定程度上表明，γ-干擾素ELISA方法的敏感性要高于PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)[2]。

PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法是國(guó)家檢測(cè)結(jié)核病的法定方法，與尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法相比，該法的保定、除毛工作強(qiáng)度較大其結(jié)果判定（肉眼觀察和量皮）易受人為因素影響[3]。而PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法則保定相對(duì)容易，結(jié)果判定也相對(duì)容易、方便，受人為因素影響相對(duì)較少。PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法更適用于中小型牛場(chǎng)，PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法更適合大型規(guī)模化牛場(chǎng)。γ-干擾素ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)、省力、結(jié)果判定容易，缺點(diǎn)是成本較高，需要有專業(yè)的化驗(yàn)人員和化驗(yàn)條件，更適合在大型規(guī)范化牛場(chǎng)及效益高的萬(wàn)頭牛場(chǎng)應(yīng)用。