解春寶，羅江蓉，黃文芳，傳良敏，喻 華，楊永長，姜 偉，鐘 敏，肖代雯

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.急診科，四川 成都 610072)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭陰性條件致病菌，存在于正常人的皮膚、呼吸道和泌尿道，也廣泛分布于水及土壤。鮑曼不動(dòng)桿菌具有強(qiáng)大的獲得耐藥性和克隆傳播的能力，是引起醫(yī)院內(nèi)患者感染的最主要細(xì)菌[1]。該菌可引起身體各種組織或器官部位的感染，導(dǎo)致的疾病有軟組織感染肺炎、菌血癥、腦膜炎和尿路感染等[2]。鮑曼不動(dòng)桿菌在全世界范圍內(nèi)備受關(guān)注。目前臨床使用的傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和基于生化反應(yīng)來鑒定細(xì)菌是診斷細(xì)菌感染的最公認(rèn)的方法，但傳統(tǒng)的方法缺陷在于培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)間較長、且容易受到接種時(shí)間和方法等因素的影響，較難達(dá)到對感染早期診斷的目的[3]。所以快速而準(zhǔn)確的鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌非常重要。本研究利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)快速鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器普通血平板和麥康凱瓊脂平板購自鄭州安圖公司；離心機(jī)購自美國BECKMAN COULTER；全自動(dòng)微生物分析儀VITEK2 Compact購自法國梅里埃公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)和乙腈(ACN)購自美國Sigma公司；Proteinchip Software、SELDI-TOF-MS分析軟件購自美國Ciphergen Biosystems；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像儀和Au芯片購自美國Bio-Rad公司；2×Taq PCR masterMix和100 bp DNA Ladder購自北京康為世紀(jì)公司；GoldViewTM核酸染料購自北京賽百盛公司；引物由上海英俊公司合成。

1.2研究菌株收集我院2014年1～10月臨床菌株：鮑曼不動(dòng)桿菌60株、大腸埃希菌30株、肺炎克雷伯桿菌20株、產(chǎn)酸克雷伯菌8株、陰溝腸桿菌19株、奇異變形桿菌7株、枸櫞酸桿菌4株、粘質(zhì)沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌16株、金黃色葡萄球菌24株、溶血葡萄球菌16株。利用VITEK2 Compact自動(dòng)微生物分析儀對所有菌株進(jìn)行鑒定。

1.3方法

1.3.1菌株分組 將所有研究菌株分成訓(xùn)練組和驗(yàn)證組。訓(xùn)練組：鮑曼不動(dòng)桿菌40株、大腸埃希菌20株、肺炎克雷伯桿菌10株、產(chǎn)酸克雷伯菌8株、陰溝腸桿菌10株、奇異變形桿菌7株、枸櫞酸桿菌4株、粘質(zhì)沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌10株、金黃色葡萄球菌14株、溶血葡萄球菌10株。驗(yàn)證組：鮑曼不動(dòng)桿菌20株、大腸埃希菌10株、肺炎克雷伯桿菌10株、陰溝腸桿菌9株、表皮葡萄球菌6株、金黃色葡萄球菌10株、溶血葡萄球菌6株。

1.3.2細(xì)菌培養(yǎng) 由于所有收集菌株保存于-80 ℃冰箱，在研究前將菌株復(fù)蘇后接種相應(yīng)平板，在溫度為35 ℃、CO2濃度為6.5%條件下對菌株培養(yǎng)24 h，然后取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種平板，在相同條件下對菌株再次培養(yǎng)24 h，以便獲得純菌落。

1.3.3多重PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌 利用ITS引物擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌的間隔序列，將內(nèi)參基因recA引物擴(kuò)增不動(dòng)桿菌屬的高度保守序列。利用煮沸法提取DNA：挑取血平板上的菌落3～4個(gè)，加入300 μl雙蒸水的1.5 ml EP管中，震蕩混勻后在沸水中煮10 min然后以12 000轉(zhuǎn)/min速度離心5 min，上清液即為模板DNA用于鮑曼不動(dòng)桿菌基因測定。參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)多重PCR的引物，recA：F 5'-CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC-3'，R 5'-GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC-3'，大小約為425bp； ITS：F 5'-CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG-3'，R 5'-AGA GCA CTG TGC ACT TAA G-3'，大小約為208 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括：12 μl 2×Taq Master Mix，9 μl dH2O，ITS正反向引物各1 μl(10 μmol/L)，recA正反向引物各0.5 μl(10 μmol/L)，模板1 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min，30循環(huán)周期(94 ℃變性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延生30 sec)，72 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后用凝膠成像儀檢測。同時(shí)擴(kuò)增出的recA和ITS片段，確定為鮑曼不動(dòng)桿菌。只擴(kuò)增出recA，為其它種的不動(dòng)桿菌。

1.3.4標(biāo)本處理 從培養(yǎng)皿上收集純菌落于裝有滅菌水的1.5 mlEP管中，漩渦混勻，經(jīng)10 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄去上清。在上一步的沉淀中加1 ml滅菌水混勻后10 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄去上清留下沉淀，充分混勻后備用。

1.3.5校準(zhǔn)儀器 使用前需對質(zhì)譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)品為：Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)、Myoglobin(MW16 950)。

1.3.6上樣 取“1.3.4”部分處理好的細(xì)菌懸液4 μl與50%飽和SPA按照1：1比例混勻，將混勻好的標(biāo)本點(diǎn)在AU芯片上，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)4次，在室溫條件下干燥5 min。最后在每個(gè)樣本孔中加入2 μlSPA(50%飽和)，等其干燥后進(jìn)行儀器檢測。

1.3.7數(shù)據(jù)采集和分析 利用蛋白芯片PBSⅡ-C型閱讀機(jī)采集檢測數(shù)據(jù)。設(shè)置儀器參數(shù)(激光強(qiáng)度190，檢測敏感度為8)，利用Ciphergen proteinchip軟件對檢測結(jié)果數(shù)據(jù)自動(dòng)收集。鮑曼不動(dòng)桿菌和對照菌的差異蛋白峰用軟件(BioMarker Wizard和BioMarker Pattern)進(jìn)行分析，分析數(shù)據(jù)時(shí)參數(shù)設(shè)置：檢測出有分析價(jià)值的蛋白峰出現(xiàn)的頻率閾值(10%)，信噪比(S/N：7)，不同菌株中同一蛋白峰的偏差(<0.3%)，并構(gòu)建分類樹模型。利用構(gòu)建的模型對20株鮑曼不動(dòng)桿菌和51株非鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證方法為盲法。

1.3.8AU芯片洗滌及驗(yàn)證 參照文獻(xiàn)[3]對AU芯片進(jìn)行洗滌及驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1多重PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌60株鮑曼不動(dòng)桿菌在VITEK2 Compact鑒定后利用多重PCR方法能同時(shí)擴(kuò)增出recA基因(425 bp)和ITS片段(208 bp)，以確定60株菌都是鮑曼不動(dòng)桿菌。

2.2蛋白指紋圖譜結(jié)果顯示AU芯片能捕獲近72個(gè)細(xì)菌蛋白峰，篩選出在兩組之間差異明顯的56個(gè)蛋白峰，見圖1。選擇其中M/Z為1 6737.8和5763.61的蛋白峰作為候選蛋白標(biāo)志物。聚類分析的結(jié)果也顯示M/Z為1 6737.8和5763.61的標(biāo)志物表達(dá)差異最明顯。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌和對照菌的蛋白質(zhì)譜圖 橫坐標(biāo)為M/Z，縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)的豐度。鮑曼不動(dòng)桿菌 1～3為試驗(yàn)菌株，其余為對照菌。

2.3建立決策樹診斷模型利用Biomarker Wizard獲得研究數(shù)據(jù)，然后用BioMarker Pattern對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，選擇其中的差異蛋白峰構(gòu)建其分類樹模型。靈敏度在定于0.05的Gini決策分類樹法。擇優(yōu)選出M/Z為1 6737.8和5763.61兩個(gè)蛋白峰來構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌分類樹模型，見圖2。在第一個(gè)蛋白(M/Z：1 6737.8)節(jié)點(diǎn)，將149例樣本分為兩組，峰值強(qiáng)度≤4.589的樣本劃分到左邊的終結(jié)點(diǎn)1，共105例，鑒定為對照組細(xì)菌；峰值強(qiáng)度>4.589的樣本劃分到右邊的結(jié)點(diǎn)2，共44例。在第二個(gè)蛋白(M/Z：5763.61)節(jié)點(diǎn)，將44例結(jié)點(diǎn)2中的樣本分為兩組，峰值強(qiáng)度≤0.42的樣本劃分到左邊的終結(jié)點(diǎn)2，共5例，鑒定為對照組細(xì)菌；峰值強(qiáng)度>0.42的樣本劃分到右邊的終結(jié)點(diǎn)3，共39例，鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌分類樹模型

2.4AU芯片清洗及驗(yàn)證結(jié)果AU芯片經(jīng)過一系列洗滌后檢測發(fā)現(xiàn)，在分析臨床菌株蛋白峰的范圍內(nèi)(相對分子量3000～30000 Da)無殘留物質(zhì)，提示本研究中洗滌芯片的方案良好，洗凈的AU芯片可以再次使用，見圖3。

圖3 AU芯片洗滌后的檢測結(jié)果

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌作為條件致病菌，在自然環(huán)境中存在非常廣泛。這種細(xì)菌有較強(qiáng)的抵抗力，一般的濕熱、化學(xué)消毒劑、紫外線對該菌沒有作用，而且該菌特點(diǎn)是定植發(fā)生率高、耐藥性也很高[2]。鮑曼不動(dòng)桿菌是導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要細(xì)菌之一，據(jù)文獻(xiàn)[1，2]報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌在灼傷科、神經(jīng)外科和重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)最為嚴(yán)重。鮑曼不動(dòng)桿菌導(dǎo)致的感染病情嚴(yán)重且病死率較高，所以快速準(zhǔn)確的鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的微生物的鑒定方法主要是基于微生物的形態(tài)特征，生理、生化以及分子生物學(xué)上，主要有細(xì)菌染色、形態(tài)、生長特征、動(dòng)力試驗(yàn)、代謝產(chǎn)物檢測、生化試驗(yàn)、血清學(xué)、核酸雜交、PCR以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法來鑒定細(xì)菌[3]。但是傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)長、易受到接種時(shí)間及方法的影響，不能滿足臨床上早期的診斷和治療，給患者身體和經(jīng)濟(jì)上帶來極大的負(fù)擔(dān)。

SELDI-TOF-MS技術(shù)是結(jié)合了蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)的特點(diǎn)。這種方法的特點(diǎn)是：靈敏度高、通量高、可檢出低豐度和低分子量蛋白。不同屬種的細(xì)菌蛋白譜不同，相同細(xì)菌蛋白譜相似是該技術(shù)快速準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的基礎(chǔ)。早在2009年已有文獻(xiàn)[5，6]報(bào)道采用該技術(shù)對臨床分離的金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯桿菌可以進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。有其他文獻(xiàn)[3，7～9]報(bào)道該技術(shù)能快速準(zhǔn)確鑒定臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和傷寒沙門氏菌。

為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，首先利用多重PCR對全自動(dòng)微生物分析儀VITEK-2鑒定的60株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)確認(rèn)鑒定，可以確定60株菌均為鮑曼不動(dòng)桿菌。其次采用蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)品Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)和Myoglobin(MW16 950)對質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量校準(zhǔn)，以及對芯片清洗后進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果處理。本研究利用SELDI-TOF-MS技術(shù)對60株鮑曼不動(dòng)桿菌和160株對照菌進(jìn)行蛋白峰譜分析，共檢測到72個(gè)蛋白峰(相對分子量3000～30000 Da)，其中篩選出有56個(gè)表達(dá)差異明顯的蛋白峰。將蛋白峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioMarker Pattern軟件，擇優(yōu)選出兩個(gè)蛋白峰(M/Z為1 6737.8和5763.61)構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌分類樹模型。本研究中構(gòu)建的鑒定模型簡單，分兩層3個(gè)葉結(jié)點(diǎn)，利用這兩個(gè)差異蛋白峰鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌的正確率為97.5%，鑒定本實(shí)驗(yàn)中的對照菌正確率為100%。采用盲法(鮑曼不動(dòng)桿菌20株、對照菌51株)進(jìn)行了驗(yàn)證，其靈敏度和特異性分別為85%、100%。提示該模型的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性均較高。以上結(jié)果提示利用SELDI-TOF-MS可對鮑曼不動(dòng)桿菌菌株進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。由于本文未納入更過種屬細(xì)菌和其他不動(dòng)桿菌，故這兩個(gè)蛋白峰(M/Z為1 6737.8和5763.61)構(gòu)建的鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定模型還需要納入更多菌株進(jìn)行的驗(yàn)證。

SELDI-TOF-MS是基于核糖體蛋白的差異對細(xì)菌進(jìn)行鑒定，屬于表型分析。所以該技術(shù)對一些在進(jìn)化過程中極其接近，即菌種間核糖體蛋白差異極小的細(xì)菌鑒別有一定的難度。且利用SELDI-TOF-MS建立的診斷模型每次只能鑒定一種細(xì)菌，故該技術(shù)暫時(shí)還沒能在臨床上進(jìn)行廣泛的應(yīng)用，有待研究者進(jìn)一步探索。