曹雨虹, 張明勇, 劉 敏, 洪戰(zhàn)英*

(1. 第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室, 上海市藥物(中藥)代謝產物研究重點實驗室, 上海 200433;2. 第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部, 上海 200433)

在神經分支的發(fā)生和生長以及神經交流/神經電路的發(fā)展中,腦神經傳遞是一個重要的過程[1]。神經遞質(neurotransmitters, NTs)是能夠促進神經傳遞的內源性化學信使,在許多大腦功能中發(fā)揮重要作用,包括行為和認知。它們影響并且調整肌肉張力和心率,調節(jié)學習、睡眠、記憶、意識、情緒和食欲。在正常的生理條件下,神經遞質在細胞中形成神經網絡控制著突觸功能。神經遞質通常儲存在突觸小泡中,并通過適當的信號釋放到突觸中,釋放的神經遞質通過突觸間隙建立連接并與相應受體結合,完成突觸傳遞。

中樞神經系統(tǒng)中神經遞質濃度的變化與許多精神和生理疾病有關,例如阿爾茨海默癥(Alzheimer disease, AD)、帕金森氏癥、精神分裂癥、癲癇、心律失常、甲狀腺激素缺乏癥、充血性心力衰竭等,因此神經遞質濃度的檢測是研究這些疾病的一個重要手段。神經遞質在生物樣品中的含量很低,且本身熒光響應和質譜響應信號不強,而生物樣品本身基體復雜,內源性干擾物質較多,因此NTs的分析檢測存在極大困難。建立快速高效的樣品前處理方法和靈敏的檢測手段仍是目前深入開展神經遞質研究需要解決的問題。本文對一些常見的神經遞質,如多巴胺(dopamine, DA)、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、腎上腺素(epinephrine, EP)和去甲腎上腺素(noradrenalin, NE)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等的定量檢測方法以及在一些疾病研究中的應用現狀進行綜述(見圖1)。

圖 1 神經遞質常見的檢測方法及其在不同疾病中的應用Fig. 1 Common detection methods of neurotransmitters (NTs) and their applications in different diseasesACh: acetylcholine; 5-HT: 5-hydroxytryptamine; DA: dopamine; GABA: gamma-aminobutyric acid; NE: noradrenalin.

1 神經遞質及其與疾病的關系

神經遞質可分為生物胺類、氨基酸類、ACh類等,通過突觸間隙建立連接并與相應受體結合,完成突觸傳遞。到目前為止,已經鑒定了100多種神經遞質。

單胺類神經遞質是功能重要的腦神經遞質,由兒茶酚胺(DA、NE和EP)和5-HT組成。DA和5-HT在大腦中起關鍵作用,控制運動、情緒和行為[2]。DA神經元主要位于中腦黑質致密部位,中腦腹側被蓋區(qū)域和下丘腦[3]。5-HT在呼吸、體溫和情緒的自主控制中也被認為起著重要作用[4]。

ACh是1921年發(fā)現的第一個神經遞質[5],分布于神經肌肉接頭、腦、脊髓和自主神經系統(tǒng)中。ACh在記憶與學習中起著關鍵作用,同時還起著調節(jié)皮質結構、腦血液動態(tài)和睡眠周期的作用。有文獻[6]報道乙酰膽堿神經元與AD的發(fā)病機制有關。

Glu是大腦中樞神經系統(tǒng)(CNS)中的主要興奮性神經遞質。Glu在突觸傳遞,組織和與疾病相關的神經元遷移中起關鍵作用[7]。除了在CNS中的重要生理功能外,Glu還在許多疾病(諸如癲癇、神經變性疾病和中風)的病理生理學中起關鍵作用[8]。Glu的過量釋放導致突觸后膜Glu受體過度被激活,引起神經功能障礙和變性,在一定程度上會產生神經興奮性毒性,進而引發(fā)腦缺血損傷。

GABA是成熟CNS中的主要抑制性神經遞質。它通過控制中間神經元的活動模式來調節(jié)神經網絡的動態(tài)。GABA在調節(jié)腦修復中起重要作用[9],在早期腦缺血和再灌注期間,GABA神經傳遞的喪失會導致持續(xù)的神經元興奮性并可能導致神經元死亡[10]。

2 神經遞質的定量檢測方法

針對神經遞質檢測已報道的方法可總結為儀器分析方法、電化學傳感器、新興材料檢測法3大類。在神經遞質檢測中使用較為廣泛的儀器分析法,主要包括高效液相色譜(HPLC)法、高效毛細管電泳(HPCE)法、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)法以及液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)法等。

2.1 HPLC法

HPLC法是應用較為廣泛的定量分析方法,具有良好的選擇性和較低的檢出限。HPLC法應用于神經遞質檢測時所采用的檢測器有紫外-可見光(ultraviolet-visible, UV-VIS)檢測器、熒光(fluorescence, FL)檢測器和電化學檢測器(electrochemical detection, ECD)。多數神經遞質熒光基團和可供離子化的官能團不多,對熒光和質譜的響應信號較弱,且生物樣品基質復雜,內源性干擾物質多,因此采用紫外可見光或熒光檢測器、衍生化(分離前或分離后)常常是必要的。ECD由于檢測靈敏度高、操作簡單,且對于兒茶酚胺和吲哚胺類化合物的檢測無需衍生化,應用日益廣泛。ECD檢測可以通過庫侖法或安培法進行,庫侖法具有較低的檢出限。

Chen等[11]選用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑,采用HPLC-庫侖法結合微透析技術檢測大腦中5種氨基酸類神經遞質的含量。該方法檢出限可達1.5～5.7 nmol/L,可用于體內神經遞質的連續(xù)監(jiān)測。Sanli等[12]采用3(4-羧基苯甲?；?-2-喹啉環(huán)甲醛為衍生試劑,建立了RPLC-FL方法檢測大鼠和小鼠脊髓組織中4種氨基酸類神經遞質:Glu、甘氨酸(Gly)、?；撬?Tau)和GABA,由于大多數氨基酸的發(fā)光強度較弱,采用柱前衍生法進行熒光檢測提高了重現性和靈敏度。同時柱前衍生化增加了分析物的疏水性,使其足以保留在反相固定相上。在最佳條件下,對于所有分析物,在0.50～50.00 mol/L的濃度范圍內,線性相關系數為0.991 2至0.999 7,檢出限范圍為0.03～0.06 mol/L。

2.2 HPCE法

HPCE具有進樣量小(最低可達nL級)、分析時間短和柱效高的特點,常與微透析技術和在線柱前衍生技術聯(lián)用,在體內氨基酸類神經遞質的分析和連續(xù)監(jiān)測方面具有明顯的優(yōu)勢[13]。大腦微透析、毛細管電泳(CE)與激光誘導熒光檢測的聯(lián)合使用,對神經遞質的外排物可以做到以每10 s一次的同步監(jiān)測。激光誘導熒光檢測技術相較于傳統(tǒng)的熒光檢測技術與毛細管電泳聯(lián)用可達到更低的檢出限。

Jako等[14]采用氟代試劑(7-氟-4-硝基-1,1,3-苯并惡二唑)為衍生化試劑,毛細管電泳與激光誘導熒光(LIF)聯(lián)用技術檢測生物樣品中D-絲氨酸(D-Ser)、D-天冬氨酸(D-Asp)與Glu和Asp。D-Ser與D-Asp的定量限為0.05 μmol,該方法成功應用于成年小鼠的不同腦區(qū)中D-Asp和D-Ser含量檢測。Lorenzo等[15]建立了簡單、快速的CE-LIF檢測方法,用來檢測尿液、海馬體組織樣品中多種氨基酸的含量。該方法采用4-氟-7-硝基2,1,3-苯并惡二唑(NBD-F)為衍生化試劑,并且只需10 μL尿液或20 mg海馬組織,衍生化時間為15 min,分析時間為20 min,靈敏度可達nmol級。該方法成功應用于檢測糖尿病患者尿液中Glu、Gly、D-Ser、Tau、Asp、苯丙氨酸(Phe)和Ser 7種氨基酸含量。Li等[16]采用腦微透析技術獲得下丘腦細胞外液透析液,建立了同時測定多種氨基酸類神經遞質的HPCE方法。該方法采用異硫氰酸熒光素為衍生劑,為了達到最佳分離狀態(tài),上樣緩沖液中加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS)和3種有機改性劑(甲醇、乙腈和異丙醇),同時測定丘腦細胞外液透析液中多種氨基酸類神經遞質含量,研究了腦缺血/再灌注過程中神經遞質和神經調節(jié)劑的動態(tài)變化。

2.3 GC-MS法

GC-MS法也可用于神經遞質的定量檢測,與LC相比,GC通常具有更高的峰容量、更少的基質效應、更高的穩(wěn)定性和靈敏度。質譜具有高選擇性、高靈敏度以及結構判定等優(yōu)勢。目前GC-MS法應用于檢測神經遞質時同樣需要樣品純化處理和衍生化。Aragon等[17]采用GC-MS法測定暴露于低濃度具有神經毒性農藥和甲基汞等化學物質中的斑馬魚幼魚中單胺類神經遞質(MNT)的含量變化。該方法在樣品前處理時采用兩步衍生化:N-甲基-2-七氟丁胺(BMHFBA)用于N-全氟?；磻?六甲基二硅氮烷(HDMS)用于O-硅烷化反應。方法的檢出限和定量限分別為0.4～0.8 μg/L和1.2～2.7 μg/L。雖然未檢測到視覺畸形,但在斑馬魚早期發(fā)育過程中MNT水平變化顯著。結果表明,產生神經毒性的化學物質可以改變神經遞質水平,從而可能影響早期腦發(fā)育。

2.4 LC-MS法

LC-MS法將色譜的高分離性能和質譜鑒別力強的特點相結合,許多劑量小藥效強的藥物及其代謝產物多為極性強、難揮發(fā)的化合物,LC-MS法彌補了傳統(tǒng)液相檢測器的不足,成為了體內藥物分析中不可或缺的有效檢測手段。近年來,LC-MS檢測神經遞質的應用日漸增多,表1列舉了一些實例,包括樣品前處理方法及其相應檢出限等。

表 1 LC-MS測定生物樣品中神經遞質含量Table 1 Determination of NT contents in biological samples by LC-MS

DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction; ILUSA: ionic liquid based ultrasound assisted; SCX/SPE: strong cation exchange/solid phase extraction; LLME: liquid-liquid microextraction; LLOQ: lower limit of quantitation; CNS: central nervous system.

由于生物樣本中(包括血漿、尿液和腦組織等)神經遞質的含量較低且內源性化合物干擾較大,采用LC-MS法檢測時樣品前處理是有必要的。傳統(tǒng)的前處理技術包括液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取(solid phase extraction, SPE)。近年來,出現一些新的微萃取技術,包括填充吸著劑微萃取(microextraction by packed sorbent, MEPS)[32]、固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)[33]、分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)。DLLME是基于合理的萃取溶劑和分散溶劑混合物開發(fā)的萃取技術,只需要少量的有機溶劑,當快速注入液體樣品后形成渾濁溶液并且樣品和萃取溶劑之間快速達到平衡,而完成目標化合物的萃取。SPME是一種多用途的提取方法,需要非常少的溶劑量便可達到同時萃取和富集多種分析物的作用。然而,SPME纖維壽命是有限的。MEPS是一種用于樣品純化的小型化固相萃取技術,但與一般SPE有顯著差異,它是把吸著劑直接集成到注射器中,而不是一個單獨的小柱子,因此可用于100次以上的萃取純化,而常規(guī)固相萃取小柱只能使用1次。MEPS可以與GC-MS、LC-MS、毛細管電色譜-質譜聯(lián)用。用注射器作為進樣裝置,可以實現自動化,包括樣品處理、萃取和注射等步驟[34]。傳統(tǒng)的前處理技術需要較長的處理時間和大量的有機溶劑,這些新技術具有效率高、操作簡單快速和成本低的優(yōu)點,已逐漸應用于生物樣品神經遞質測定的處理。

2.抓安全教育。對HSE工作遵循“安全第一、預防為主”的原則，安全工作經常抓、抓日常，積極宣貫落實《安全生產禁令》《員工守則》和崗位責任制，開展了“人人都是安全員”、排查身邊的隱患、“我能安全”演講、書法作品征集等活動；開辦了“安全生產小課堂”，利用周一生產會的時機，集中20分鐘的時間，分析案例，講解注意事項、家庭生活安全常識、夏季防暑降溫技巧等知識；在單元親情提示牌、服務大廳等顯著位置張貼、發(fā)放“安全防范溫馨提示七字歌”等宣傳品，提醒大家做好安全防范，提高了全員的安全意識。

Jha等[19]采用離子液體超聲輔助分散液-液微萃取(IL-USA-DLLME)結合LC-MS法檢測大鼠腦組織、血漿和細胞內15種神經遞質的含量,該檢測方法快速、靈敏、經濟且無需衍生化。前處理過程中采用離子液體替代了傳統(tǒng)的有毒溶劑作為提取溶劑,將萃取溶劑(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽,BMIMPF6)和分散溶劑(乙腈)的混合物快速注射到樣品基質中,渦流攪拌和超聲,離心,萃取相在下層。實驗過程中所需溶劑量少,分析時間快,從樣品制備到儀器分析時間不超過15 min。該分析方法具有良好的選擇性,成功應用到不同生物基質(大鼠腦組織、大鼠血漿和細胞樣品)中神經遞質含量的測定,檢出限在大鼠腦組織中可達到0.021～0.912 μg/L,在大鼠血漿中可達到0.028～0.978 μg/L,在細胞樣品中可達到0.025～0.945 μg/L。Zhang等[35]采用N-叔丁氧羰基-L-色氨酸-羥基琥珀酰亞胺酯(Boc-TRP)作為衍生化試劑同時測定大鼠大腦微透析樣本的多種神經遞質。在三重四極質譜分析中,衍生化產物中的叔丁氧基基團顯示出獨特的碎片化模型,極大地提高了特異性和敏感度。該研究建立的快速LC-MS定量分析法線性范圍寬,相關系數大于0.990。在室溫下,Boc-TRP衍生劑在磷酸根緩沖液(pH 7.4)中衍生速度較快,衍生的神經遞質在HPLC中可快速分離。

單胺類神經遞質為強極性物質,在反相色譜柱上保留極弱,且離子化效率低,質譜響應信號不強,降低了質譜檢測的靈敏度。通過衍生化處理可以改善單胺類神經遞質的色譜保留行為和離子化效率。二乙基可降低單胺類神經遞質的極性,提高離子化效率。氨基酸類神經遞質含有羧基、羥基、氨基等極性基團,采用LC-MS法檢測時需要先對其衍生化以提高待測物的分離度和靈敏度。氨基酸類神經遞質常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-C)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丙酸酐等。這些傳統(tǒng)的衍生化試劑都有各自的缺點,如OPA不能和仲氨酸反應,與胱氨酸的衍生物產生的熒光強度較低且不穩(wěn)定;Dansyl-C的衍生化時間較長,同時Dansyl-C及其衍生物容易見光分解。近年來新的衍生化試劑不斷出現,如Zhao等[26]采用10-乙基-阿啶酮-3-磺酰氯(EASC)為衍生試劑,開發(fā)了同時測定多種單胺類神經遞質和氨基酸類神經遞質的LC-MS法;Zhao等[30]等采用衍生化試劑4-氯代羰基羅薩明(CCR)建立了LC-MS法測定大鼠尿液中氨基酸類和單胺類神經遞質的含量。如何選擇合適的衍生化試劑、簡化衍生化步驟、提高衍生化效率、使衍生產物穩(wěn)定且無相互干擾是LC-MS法應用于神經遞質檢測的關鍵。Zheng等[36]首次提出穩(wěn)定同位素標記衍生化與超聲輔助DLLME聯(lián)用技術,采用LC-MS法同時測定單胺類神經遞質(MANT)及其生物合成前體和相應代謝物。質譜敏化試劑d0-10-甲基-阿啶酮-2磺酰氯和d3-10-甲基-嘧啶-2-磺酰氯作為同位素探針來標記神經遞質可降低質譜分析中的基質效應。該方法已成功應用于帕金森病模型和正常大鼠腦微透析液中神經遞質含量的測定。

2.5 電化學傳感器法

儀器分析方法通常需要昂貴的儀器設備,操作比較耗時。近年來,一些研究人員[37]使用獨特的材料開發(fā)生物傳感器,用于體內神經遞質的檢測。這些傳感器具有出色的傳感性能,如快速響應、簡單的測量程序、高靈敏度和選擇性。其中,電化學傳感器具有較好的重復性、較高的準確性及較寬的線性響應范圍,具有低檢出限和實時測量的優(yōu)點,可實現與臨床診斷和疾病治療相關分析物的快速、靈敏、選擇性和低成本檢測。

在眾多基于電化學檢測方法報道中,碳基電極的應用較為廣泛,用于體內神經遞質檢測可提供較高的分辨率,碳基電極可分為玻碳電極(GCE)、石墨烯電極(GRE)、碳糊電極(CPE)等。GCE已用于多分析物檢測,玻碳通常用作幾種化學修飾電極的底物。石墨烯(Gr)是極薄的材料,比金剛石更柔韌、更硬,并且在室溫下比其他材料導電更有效。Gr對某些物質具有優(yōu)異的電子轉移促進能力,對小分子具有優(yōu)異的催化性能。CPE由美國著名電化學家Adams[38]于1958年推出,具有制備快速簡便、成本低等優(yōu)于其他電極的優(yōu)點。碳糊材料已成為實驗室用于制備各種電極、傳感器和探測器的最流行的電極材料之一。Baluta等[39]基于石墨烯量子點(GQD)和漆酶修飾的GCE開發(fā)了一種有用的電化學傳感方法用于檢測EP。在優(yōu)化的條件下,線性范圍為1.0～1.2×10-4mol/L,檢出限為83 nmol/L。Madhu等[40]使用SnO2納米片修飾導電碳紗(CCY),用作DA的無標記檢測。采用水熱法將SnO2納米結構固定在CCY表面。在最佳實驗條件下測定DA,檢出限為53 nmol/L,線性范圍為0.01～150 mol/L。

此外,其他碳基材料如碳納米管(CNT)[41]、碳纖維(carbon fiber)[42]、貴金屬和金屬氧化物納米顆粒(NPs)[43]、離子液體(ILs)[44]、分子印跡聚合物(MIP)[45]等用于電極的修飾,以提高神經遞質檢測的靈敏度和選擇性。本文列舉了基于電化學傳感器開發(fā)的測定生物樣本中神經遞質的方法及相應的檢出限,詳見表2。

在電化學傳感器檢測方法中,除了碳基電極應用較為廣泛以外,近些年來,一些新興的納米材料用作電極材料應用于體內神經遞質的含量測定。例如,基于離子在兩種不混溶電解質溶液之間的界面上轉移的納米移液管電極可以用來檢測多種神經遞質,包括具有電化學氧化還原活性的5-HT和非氧化還原活性的ACh等神經遞質[58]。用碳量子點修飾的NiAl層狀雙氫氧化物(NiAl-LDH/CD)復合材料是電化學生物傳感器發(fā)展中出現的新興材料,該復合材料是采用水熱法合成具有交聯(lián)納米片結構和高比表面積的花狀納米材料,可修飾GCE電極應用于神經遞質的檢測[59,60]。

表 2 基于電化學傳感器方法測定神經遞質Table 2 Determination of NTs based on an electrochemical sensor method

DA: dopamine; EP: epinephrine; GCE: glassy carbon electrode; CPE: carbon paste electrode; SPE: screen-printed electrode PGE: pencil graphite electrode; ITO: indium tin oxide; CNT: carbon nanotube; PPy: polypyrrole; MWCNT: multiwalled carbon nanotubes. EDAS:N-[3(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine; AuNPs: Au nanoparticles: AzrS: Alizarin red S; 2-CBF/AZ: 2-chlorobenzoyl ferrocene/Ag-ZnO; IL: ionic liquid; Gr: graphene; Fe3O4NPs-MWCNT-poly: Fe3O4nanoparticles-multiwalled carbon nanotubes-poly; ILC/RGO: ionic liquid crystal/reduced grapheneoxide; OFMs: olive-like Fe2O3microspheres; 3D HGBs: three-dimensional hollow graphene balls; rGO: re-dispersed graphene oxide; MIP: molecularly imprinted polymer.

2.6 其他檢測方法

2.6.1光學傳感器

2.6.2生物傳感器

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)具有拓撲結構,對內源性神經遞質具有高度特異性,構成大多數神經遞質和神經調節(jié)劑的受體。Jing等[65]最近通過使用GPCR支架,開發(fā)了一種具有高信噪比的ACh傳感器,可檢測體內/體外環(huán)境中ACh的信號,在從幾種動物物種制備的十幾種類型的神經元和非神經元細胞中通過轉染病毒和轉基因表達得到驗證。結果顯示,該傳感器選擇性地響應外源和內源ACh信號。最近,Moreira等[66]提出了基于混合酶燃料電池的第一傳感器用于ACh的實時原位檢測,該方法不需要樣品處理,響應時間在3 min內。這種方法說明ACh的實時監(jiān)測朝著自動供電的廉價設備邁出了重要一步。

3 應用

一些神經系統(tǒng)疾病與神經遞質濃度的微小變化密切相關,因此,神經遞質的測定成為疾病診斷和監(jiān)測以及治療干預的重要手段。多種分析方法已被用于研究神經系統(tǒng)疾病中神經遞質水平的變化,如AD、抑郁癥、唐氏綜合征、亨廷頓病、帕金森病和精神分裂癥等。探討各種疾病模型中特定神經遞質的動態(tài)變化可為研究人員提供有關潛在致病機制的重要信息,有效的神經遞質體內監(jiān)測可以反映治療效果,從而為臨床合理用藥乃至新的藥物設計和新治療方法提供科學依據。

3.1 AD

AD是一種神經退行性疾病,其特征是記憶和其他認知功能逐漸喪失。已有研究[67]表明,膽堿能神經元的退化在與AD相關的認知衰退中起主要作用。如前所述,神經遞質是通過在突觸前神經元發(fā)送信號來維持突觸和認知功能的必需的神經化學物質,通過研究神經遞質的變化以確定它們在AD中的作用,并有助于診斷AD。Zhao等[30]采用原位超聲輔助衍生DLLME前處理技術結合LC-MS聯(lián)用技術檢測AD模型大鼠尿液中氨基酸類和單胺類神經遞質的含量。該方法可在16 min內同時檢測22種分析物,檢出限達1×10-4～1×10-2nmol/L。應用該方法對正常組和AD模型組大鼠尿液中的神經遞質含量進行檢測,結果(見圖2)表明,AD模型組大鼠尿液中DL-3,4-二羥基苯基乙二醇(DHPG)以及3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)含量顯著高于正常對照組(p<0.01)。GABA和Gly也明顯高于對照組,而AD大鼠尿中L-3,4-二羥基苯基丙氨酸(L-DOPA)、DA、NE、去甲變腎上腺素(NME)、3-甲氧基酪胺鹽酸鹽(3-MT)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、DL-3,4-二羥基扁桃酸(DOMA)、香草扁桃酸(VMA)、5-HT和Asp水平顯著低于正常對照組(p<0.01)。Hsieh等[68]建立了一種簡單的環(huán)糊精毛細管區(qū)帶電泳方法,并配有激光誘導熒光檢測器,用于分析興奮性氨基酸Asp和Glu。血漿和腦脊液(CSF)樣品經離心過濾裝置預處理后,去除高分子量蛋白質,然后用106-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜(DMSO)中衍生化。應用該方法測定了26例AD患者血漿和腦脊液中Asp和Glu的濃度,并研究了這些遞質濃度與疾病嚴重程度的關系(見圖3)。統(tǒng)計學結果顯示,血漿和腦脊髓液中Asp及Glu濃度與AD嚴重程度呈負相關。以上分析方法在AD疾病的臨床診斷,監(jiān)測治療效果和藥物評價方面具有潛在價值。

圖 2 正常和AD組(a)DA及其代謝產物和(b)5-HT及其代謝產物的濃度(n=8)[30]Fig. 2 Concentrations of (a) DA and its metabolites and (b) 5-HT and its metabolites in normal and Alzheimer disease (AD) groups (n=8)[30] L-DOPA: L-3,4-dihydroxyphenylalanine; E: epinephrine; 3-MT: 3-methoxytyramine hydrochloride; NME: normetanephrine; ME: metanephrine; DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylacetic acid; HVA: homovanillic acid; DOMA: DL-3,4-dihydroxymandelicacid; DHPG: DL-3,4-dihydroxyphenyl glycol; VMA: vanillylmandelic acid; MHPG: 4-hydroxy-3-methoxyphenylglycol; 5-HIAA: 5-hydroxyindole-3-acetic acid.

圖 3 血漿和腦脊液(CSF)中D-Asp/L-Asp和Glu的電泳圖譜[68]Fig. 3 Electropherograms of D-Asp/L-Asp and Glu in plasma and cerebrospinal fluid (CSF)[68] a. plasma sample from an AD patient; b. plasma sample from a non-AD patient; c. CSF sample from an AD patient; d. CSF sample from a non-AD patient. Peak Nos.: 1. D-Glu; 2. L-Glu; 4. L-Asp.

3.2 抑郁癥

抑郁癥是一種以情緒低落、自我價值感降低、快感缺失為主要癥狀的精神類疾病。重度抑郁癥(MDD)涉及多種神經遞質的紊亂,包括GABA、DA、5-HT等[69]。Wojnicz等[25]建立了一種快速的LC-MS方法測定大鼠腦組織中的神經遞質:EP、NE、Glu、GABA、DA、5-HT、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)及MHPG。定量限為0.25～250 μg/L。此方法成功應用于檢測Nrf2基因剔除的小鼠抑郁癥模型內源性神經遞質及其代謝產物,結果發(fā)現,小鼠海馬樣本中NE、5-HT、DA、5-HIIA、Glu 5種化合物在基因剔除小鼠與正常小鼠之間無明顯差別,但基因剔除小鼠海馬樣本中GABA的含量明顯減少。該研究首次報道Nrf2基因剔除的小鼠海馬組織中GABA水平,也支持了抑郁癥Glu缺陷假說。該實驗有助于尋找抑郁癥和其他相關疾病的生物標志物,提高神經遞質水平變化相關疾病的診治水平和效率。

3.3 缺血性中風

缺血性中風是指腦血栓形成或在腦血栓的基礎上導致腦梗死、腦動脈堵塞而引起的偏癱和意識障礙,不僅發(fā)病率高,也具有較高的病亡率以及致殘率。神經元中興奮性神經遞質Glu和Asp過度釋放產生的神經毒性與腦缺血性損傷有關,目前這些神經遞質已成為科學家們研究中風治療方法的目標[70]。王展等[71]采用LC-MS/MS法測量比較卒中組以及正常對照組血漿內的5-HT、NE、Glu和GABA 4種神經遞質的濃度。同時比較不同卒中嚴重程度患者的4種神經遞質濃度。結果表明,血漿神經遞質與正常對照組相比,血漿5-HT、NE和Glu有上升趨勢,GABA有下降趨勢;缺血性卒中急性期血漿神經遞質水平與正常對照組相比有差異,中重度卒中患者的血漿5-HT水平升高較輕度卒中患者顯著。

3.4 精神分裂癥

精神分裂癥是一種相對常見、慢性且常常具有毀滅性的神經精神疾病。嚴重癥狀通常出現在青春期晚期或成年早期,涉及認知、情緒和行為異常。到目前為止,還沒有生物學驗證或實驗室試驗可以診斷該疾病,也沒有生物標志物可以評價治療效率。血漿中神經遞質水平含量的變化可能會影響神經分裂癥患者的情緒敏感程度和治療效果。Diego等[72]采用LC-MS/MS法同時檢測人血漿中多種神經遞質和氨基酸的含量,血漿樣本來自35例精神分裂癥患者(其中27例患者接受氯氮平藥物治療,8例患者接受奧氮平治療)和38名健康志愿者。該測定方法可實時監(jiān)測治療效果。結果顯示,與對照組(健康志愿者)比較,奧氮平治療精神分裂癥患者血漿中蛋氨酸水平顯著較高,氯氮平治療精神分裂癥患者血漿中Glu水平明顯升高。該方法可成功應用于監(jiān)測臨床治療效果。

4 結論與展望

神經遞質在診斷和治療精神障礙疾病中起著至關重要的作用,因此在各種環(huán)境中實時、準確地檢測其濃度尤為必要。生物介質中神經遞質的定量測定可采用儀器檢測方法,電化學檢測方法及一些基于光學傳感器和生物傳感器的檢測方法。儀器分析方法具有良好的選擇性和較低的檢出限。電化學傳感器法具有較好的重復性、較高的準確性以及較寬的線性范圍,并且具有低檢出限和實時測量的優(yōu)勢,可用于神經遞質的快速檢測,但暫時無法實現多種神經遞質的同時測定。基于光譜分析法開發(fā)的新型生物傳感器應用于神經遞質的檢測,可達較低的檢出限并具有良好的選擇性,但目前還處于理論研究階段。未來關于神經遞質檢測的研究方向還是聚焦于開發(fā)出同時檢測多種神經遞質且無相互干擾的分析方法。應用于體內檢測時,需要考慮生物兼容性、穩(wěn)定性、靈敏度、重復性等。碳基材料用于神經遞質檢測具有良好的生物兼容性,但目前研究還處于初級階段;儀器分析方法則致力于開發(fā)操作簡便、省時省力、對環(huán)境友好的前處理方式,且可同時檢測多種神經遞質。隨著各類分析技術的發(fā)展,越來越多新技術和新方法有望實現快速、準確、實時檢測生物基質中的神經遞質,為神經系統(tǒng)疾病診斷和治療提供科學依據和技術支撐。