樂勝鋒, 王 尉, 王雅萱, 趙新穎

(北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室, 北京 100094)

蘆薈是一種極具藥用價值和經濟價值的植物,其多糖成分具有抗腫瘤、抗輻射、抗病毒等作用[1-3]。由于品種、種植條件、提取方式不同,蘆薈多糖的組成和含量也有很大差異。因此,建立一種快速、準確測定蘆薈多糖含量和組成的方法,可以滿足蘆薈多糖功能研究和質量監(jiān)控的需求,促進蘆薈經濟效益的開發(fā)。然而,多糖一般由單糖通過糖苷鍵聚合而成,結構復雜、種類繁多,聚合度差異很大,標準樣品少,直接測定多糖含量難度很大。目前普遍采用的方法是將多糖水解為單糖,再利用氣相色譜[4,5]和液相色譜[6-8]等方法測定單糖的含量,從而得到多糖的組成和含量。單糖不易揮發(fā)且基本沒有紫外或熒光吸收[9,10],利用氣相色譜法檢測,需要將單糖衍生為易揮發(fā)物質;利用液相色譜法檢測,則需要將單糖衍生為具有紫外或者熒光吸收的物質。衍生過程操作繁瑣,結果誤差較大。液相色譜-質譜法[11,12]靈敏度高且不需衍生,但存在色譜柱失效快、檢測干擾大的問題。離子色譜-脈沖安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector, HPAEC-PAD)是近年發(fā)展起來的一種糖類物質分析方法[13-18],單糖經高效陰離子交換色譜柱分離后在安培檢測器的金電極表面發(fā)生氧化反應,引起電流變化而被檢測,避免了衍生過程。該方法具有選擇性好、靈敏度和準確度高的優(yōu)勢[19-21],可以用于半乳糖、葡萄糖、甘露糖等單糖的測定[22-25]。目前,尚未見利用該法同時測定蘆薈多糖中巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖的報道。

本文優(yōu)化了蘆薈多糖的三氟乙酸水解條件和離子色譜分離條件,建立了基于CarboPac PA10色譜柱同時測定蘆薈多糖水解產物中常見7種單糖(圖1)的HPAEC-PAD法,克服了鼠李糖與阿拉伯糖、甘露糖與木糖分離度低的困難,提高了結果的準確性。

圖 1 7種單糖的結構式Fig. 1 Chemical structures of seven monosaccharides

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ICS5000型離子色譜儀,配有安培檢測器,Chromeleon 6.8色譜工作站,Dionex CarboPac PA20色譜柱(150 mm×3 mm, 6.5 μm), CarboPac PG20保護柱(30 mm×3 mm, 6.5 μm), Dionex CarboPac PA10色譜柱(250 mm×4 mm, 10 μm)和CarboPac PG10保護柱(50 mm×4 mm, 10 μm)(美國Thermo Fisher Scientific公司); Milli-Q Integral 3超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); XS205電子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Reference 2可調量程移液器(200 μL、1 000 μL,德國Eppendorf公司)。

巖藻糖(純度>98%)、阿拉伯糖(純度>99%)、半乳糖(純度>99%)、甘露糖(純度>99%)和木糖(純度>99%)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。鼠李糖(純度>98%)購自中國食品藥品檢定研究院。葡萄糖(純度>99%)購自Sigma試劑公司。三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA,純度>99.%)購自酷爾化學試劑公司。醋酸鈉(NaOAc,純度>99.%)購自Sigma試劑公司。氫氧化鈉(質量分數(shù)50%)購自Fisher Scientific公司。無水乙醇(純度99.5%)購自北京化工廠。

實驗用中華蘆薈(學名:AloechinensisBaker)、木立蘆薈(學名:AloearborescensMiller)、庫拉索蘆薈(學名:AloebarbadensisMiller)均購自花卉市場。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取對照品,用超純水配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液,4 ℃保存,有效期1個月。分別移取各標準儲備液于100 mL容量瓶中,超純水定容,配制成不同濃度的混合標準工作溶液。

1.3 樣品處理

取蘆薈鮮葉,去皮,粉碎,稱重。按照1 g∶20 mL加入超純水,60 ℃水浴提取1 h,抽濾。按照提取液和乙醇體積比1∶4向濾液中加入乙醇,機械攪拌20 min,室溫靜置3～4 h,棄去上清液。無水乙醇洗滌沉淀兩次,冷凍干燥得蘆薈多糖樣品,室溫防潮保存。

取10 mg蘆薈多糖樣品于帶蓋樣品瓶中,加入5 mL TFA水溶液(3 mol/L),充入氮氣3 min, 100 ℃密閉水解3 h。移取2 mL溶液,50 ℃真空濃縮至干,甲醇洗滌3次,2 mL超純水復溶,過0.22 μm膜過濾。根據(jù)標準曲線范圍稀釋至合適濃度,上機測定。

1.4 色譜條件

分離柱:Dionex CarboPac PA10;保護柱:CarboPac PG10;進樣量:25 μL;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測模式:積分安培檢測器,標準四電位,工作電極為Au;梯度洗脫程序:0～16 min, 20 mmol/L NaOH; 16.1～20 min, 20～14 mmol/L NaOH; 20～25 min, 14 mmol/L NaOH; 25.1～32 min, 50 mmol/L NaOH-400 mmol/L NaOAc; 32.1～35 min, 200 mmol/L NaOH; 35.1～45 min, 20 mmol/L NaOH。其中25 min到45 min為色譜柱清洗并重新平衡的過程。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

實驗考察了色譜柱、淋洗液梯度和分離溫度對7種單糖分離的影響。比較了7種單糖在Dionex CarboPac PA10和Dionex CarboPac PA20上的分離情況。結果表明,改變淋洗梯度和分離溫度,可以有效改變7種單糖的分離。在Dionex CarboPac PA20上,隨著鼠李糖和阿拉伯糖分離度的增加,半乳糖、葡萄糖和甘露糖的分離度減小,7種單糖不能同時實現(xiàn)基線分離,尤其是半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖較為困難。柱容量較高的色譜分離柱和濃度較低的淋洗液均可以增加單糖的保留時間,有利于分離條件的優(yōu)化。因此,選用Dionex CarboPac PA10并考察了0 min到25 min內6種梯度變化對半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖4種單糖分離效果的影響(見圖2和圖3)。結果表明,梯度1和梯度6均會造成甘露糖和木糖分離度小于0.64,過高的淋洗濃度和過低的淋洗濃度均不適合甘露糖和木糖的分離。將淋洗梯度變化區(qū)間延后,以增加淋洗梯度變化對上述4種單糖分離的影響程度,如梯度2～5。梯度2中半乳糖、葡萄糖、甘露糖三者實現(xiàn)了良好的分離,但甘露糖和木糖的分離度只有0.71,其色譜峰峰寬分別為1.62 min和1.44 min,峰形較差。梯度5中各單糖分離效果最佳,半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖之間的分離度分別為1.4、1.5、0.9,雖然甘露糖和木糖仍不能實現(xiàn)基線分離,但甘露糖和木糖的峰寬分別為0.82 min和0.83 min,峰形最優(yōu)。因此,采用梯度淋洗條件(0～16.0 min 20 mmol/L NaOH; 16.1～20.0 min 20～14 mmol/L NaOH; 20.0～25.0 min 14 mmol/L NaOH),可以使7種單糖得到較好的分離(見圖4)。

圖 2 分離7種單糖的6種梯度洗脫程序Fig. 2 Six gradient programs for the separation of the seven monosaccharides

圖 3 梯度淋洗對4種單糖分離度的影響Fig. 3 Effect of gradient elution programs on the resolution of the four monosaccharides

圖 4 7種單糖混合標準溶液的離子色譜圖Fig. 4 Ion chromatogram of the mixed standard solutions of the seven monosaccharides

2.2 水解條件的優(yōu)化

三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)在80～120 ℃條件下可以破壞糖苷鍵,使多糖降解為單糖。同時,TFA易揮發(fā),水解后容易去除,是最為常用的多糖水解試劑[26,27]。以中華蘆薈多糖為實驗對象,考察了TFA的濃度、溫度和時間的影響。

2.2.1TFA用量

蘆薈多糖水解過程總體積為5 mL,考察了TFA使用量為5、15和25 mmol時在80 ℃下水解7.5 h下的效果。結果表明,5 mmol TFA時,多糖只能水解出少量的巖藻糖和甘露糖,不能檢出其他5種單糖。15 mmol和25 mmol TFA時,多糖水解均可以得到7種單糖。但只有半乳糖和葡萄糖的含量隨著TFA使用量增加略有升高,其他5種多糖均出現(xiàn)了降低。這是因為TFA濃度過低時,多糖水解不完全,不能釋放出全部單糖分子;濃度過高時,水解產生的單糖又會發(fā)生過度水解,導致含量減少[15](見圖5)。因此,實驗選擇15 mmol TFA(3 mol/L)進行水解。

圖 5 三氟乙酸使用量對單糖含量測定的影響Fig. 5 Effect of the TFA usage amount on the monosaccharide contents

2.2.2溫度

在15 mmol TFA(3 mol/L)條件下,考察了多糖在80、100和120 ℃時水解7.5 h的效果。結果表明,隨著溫度的升高,水解產生的7種單糖含量出現(xiàn)先增高后減低的趨勢,100 ℃下各種單糖含量最高(見圖6)。這是因為溫度較低通常導致水解反應不充分,而溫度較高會使多糖碳化,不利于水解反應。因此,實驗選擇100 ℃水解。

圖 6 溫度對單糖含量測定的影響Fig. 6 Effect of temperature on the monosaccharide contents

2.2.3時間

在15 mmol TFA(3 mol/L)、100 ℃下考察了水解3、7.5、12 h的影響。結果顯示,隨著時間的延長,巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖的含量均有所降低,只有鼠李糖的含量稍有增加(見圖7),這是因為水解時間過長可能會導致單糖過度水解。因此,實驗選擇水解時間為3 h。

圖 7 水解時間對單糖含量測定的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on the monosaccharide contents

2.3 方法的線性范圍、定量限和精密度

在優(yōu)化的色譜條件下,以單糖的峰面積(Y)對其質量濃度(X)進行線性回歸,得到回歸方程和相關系數(shù)。以信噪比(S/N)為10時的質量濃度為定量限。取同一濃度水平的供試品溶液測定6次并計算RSD,考察方法的精密度,結果見表1。

表 1 7種單糖的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、定量限和精密度Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of quantification (LOQs) and precisions of the seven monosaccharides

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.4 加標回收率

中華蘆薈樣品按照1.3節(jié)所示步驟處理,按照1.4節(jié)所示條件進行測定,得到樣品的含量。在此基礎上進行加標回收試驗,每個濃度平行測定6次。結果顯示,7種單糖的回收率在97.5%～102.5%之間,相對標準偏差小于5%(見表2),滿足方法學定量要求。

表 2 7種單糖在實際樣品中的加標回收率及RSD(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the seven monosaccharides in samples (n=6)

圖 8 3種蘆薈中7種單糖對比的色譜圖Fig. 8 Comparison of the seven monosaccharides from three species of aloe polysaccharides

2.5 樣品測定

取中華蘆薈、木立蘆薈和庫拉索蘆薈樣品,分別按照1.3節(jié)步驟處理,1.4節(jié)條件進行測定。結果表明,中華蘆薈、木立蘆薈和庫拉索蘆薈多糖都含有以上7種單糖(見圖8),含量見圖9。從圖9可以看出,中華蘆薈和庫拉索蘆薈中7種單糖的含量按照甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、巖藻糖依次降低,且中華蘆薈中的每種多糖除木糖外均高于庫拉索蘆薈。因此,中華蘆薈中的多糖優(yōu)于庫拉索蘆薈。木立蘆薈中7種單糖的含量按照半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖依次降低,其木糖含量在3種多糖中最高。計算得到中華蘆薈、木立蘆薈和庫拉索蘆薈多糖中巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖7種單糖成分的物質的量比分別為1∶1.4∶5.5∶16.4∶8.1∶79.4∶1.8、1∶1.6∶7.0∶25.2∶6.8∶17.3∶15.2和1∶1.4∶5.4∶13.3∶5.0∶54.0∶2.2。

圖 9 3種蘆薈多糖的單糖組成Fig. 9 Constitutions of the three species of aloe polysaccharides

3 結論

本文利用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法結合梯度洗脫,實現(xiàn)了蘆薈多糖中7種單糖的分離和定量分析。該方法無需進行衍生化操作,簡單,靈敏度高,為常見單糖的定性定量分析及多糖的單糖組成分析提供了一種快速可靠的方法,豐富了醫(yī)學、藥學、生物學等領域糖類物質的分析手段。