江丹丹, 馬玖彤, 賈 瓊

(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130012)

蛋白質(zhì)磷酸化是最重要和最普遍的翻譯后修飾之一,在細(xì)胞增殖、代謝、分化、轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。蛋白質(zhì)磷酸化的測(cè)定對(duì)于全面了解生物過(guò)程中的磷酸化途徑至關(guān)重要。目前,質(zhì)譜技術(shù)已成為分析蛋白質(zhì)磷酸化的重要手段。然而,由于磷酸化肽固有的低豐度和低電離效率,以及非磷酸化肽共存所造成的嚴(yán)重抑制,使得直接質(zhì)譜分析仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[2]。因此,在質(zhì)譜分析之前應(yīng)首先對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集[3,4]。

金屬氧化物親和色譜(MOAC)是磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中常用的一種富集技術(shù)[5],其中金屬氧化物由于存在兩性表面而與磷酸酯基團(tuán)產(chǎn)生很強(qiáng)的可逆結(jié)合力。常用的金屬氧化物一般為二氧化鈦(TiO2)、二氧化鋯(ZrO2)、五氧化二鈮(Nb2O5)和五氧化二鉭(Ta2O5)等價(jià)態(tài)較高的金屬氧化物[6,7]。近年來(lái),基于多金屬氧酸鹽(POM)的磁性材料在蛋白質(zhì)吸附方面顯示出了潛在的應(yīng)用前景[8]。POM是過(guò)渡金屬離子的高氧化態(tài)(如釩(V)、鉬(Mo)、鎢(W)等)與氧形成的納米級(jí)金屬-氧簇類化合物,由于其獨(dú)特的納米分子結(jié)構(gòu)和廣泛的物理和化學(xué)性質(zhì),引起了人們極大的興趣[9]。POM具有金屬氧化物表面的顯著特征和豐富的化學(xué)位點(diǎn),適合作為光電材料、催化劑和吸附劑[10]。

本工作提出了一種基于POM磁性納米粒子(MNPs)材料富集磷酸化肽的方法[11,12]。首先,制備半胱胺修飾的殼聚糖(CYECS)[13],以提高殼聚糖(CS)的正電性和溶解性,進(jìn)而采用層層自組裝技術(shù)[14]制備POM/CYECS磁性材料,結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測(cè)手段,用于對(duì)磷酸化肽的富集。這種POM/CYECS磁性材料結(jié)合了磁響應(yīng)快速、親水性、正電性和金屬氧化物表面大等優(yōu)點(diǎn),對(duì)磷酸化肽具有高富集選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nicolet is5型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR, Thermo Nicolet公司,美國(guó)); X射線光電子能譜儀(XPS, Thermo Electron公司,美國(guó)); X射線衍射儀(XRD, PANalytical公司,荷蘭); 5800基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Applied Biosystems 公司，美國(guó)); KQ2200DB型數(shù)控超聲清洗器(湖南長(zhǎng)沙超聲儀器有限公司); JJ-1型磁力攪拌器(江蘇江南儀器廠)。

鎢酸鈉二水合物(Na2WO4·2H2O)、氯化釓六水合物(GdCl3·6H2O)、三氟乙酸(TFA)、硅酸四乙酯(TEOS)、3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)、水合肼(N2H4·H2O)和乙腈(ACN)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三氯化鐵六水合物(FeCl3·6H2O)、醋酸鈉(NaAc)、氨水(NH3·H2O)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氫氧化鉀(KOH)、醋酸(HAc)、殼聚糖(CS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-鄰苯二甲酸酐(N-Phth)、環(huán)氧氯丙烷(EN)、異丙醇(IPA)、三乙胺(TEA)、戊二醛(GA)、半胱胺鹽酸鹽(CYE)、乙二醇、甲酸、乙醇和甲醇(北京化學(xué)試劑公司);胰蛋白酶、β-酪蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白(Sigma Aldrich公司,美國(guó))。

1.2 MNPs-(POM/CYECS)的合成

準(zhǔn)確稱取1.037 5 g Na2WO4·2H2O,分散到20 mL水中,調(diào)節(jié)溶液pH至7.5。隨后加入0.12 g GdCl3·6H2O,攪拌條件下加熱至85 ℃,得到Gd-POM固體。

稱取0.34 g CS和0.83 gN-Phth,溶解至6 mL DMF中,在氮?dú)夥諊聰嚢杓訜嶂?20 ℃,保持8 h。最后傾入冰水,得到灰褐色固體,即N-鄰苯二甲酸酐保護(hù)殼聚糖(N-PhthCS)。

稱取0.34 gN-PhthCS和0.52 g EN,溶解至10 mL DMF中,攪拌加熱至60 ℃,保持0.5 h。然后加入IPA和KOH繼續(xù)攪拌12 h,得到環(huán)氧基功能化N-保護(hù)殼聚糖(ENCS)。

稱取0.3 g ENCS和0.6 g CYE,溶解至10 mL DMF中,攪拌條件下加熱至25 ℃,保持1 h,再加入4 mL TEA，繼續(xù)攪拌8 h。將得到的產(chǎn)物用大量甲醇清洗,重新分散至20 mL N2H4·H2O中,攪拌加熱至60 ℃,保持6 h,得到CYECS,最后于60 ℃真空干燥。

稱取1.35 g FeCl3·6H2O,溶于75 mL乙二醇中,加入3.60 g NaAc,攪拌形成均勻的黃色黏稠溶液,將該溶液轉(zhuǎn)移至高壓不銹鋼反應(yīng)釜中,在烘箱中于200 ℃加熱12 h,用乙醇和水沖洗3次,在外界磁鐵的幫助下分離產(chǎn)物,得到Fe3O4納米粒子。

將350 mg Fe3O4納米粒子分散于220 mL乙醇、55 mL水和1.4 mL 25%(v/v) NH3·H2O中,超聲處理分散15 min,加入1 mL TEOS,在室溫下攪拌10 h,得到Fe3O4@SiO2。

將100 mg Fe3O4@SiO2分散至30 mL乙醇中,加入1.3 mL APTES,攪拌加熱至25 ℃,保持1 h,用乙醇沖洗3次,在外界磁鐵的幫助下分離產(chǎn)物,得到MNPs-NH2納米粒子。

將MNPs-NH2納米粒子分散至30 mL 3 mg/mL Gd-POM甲醇溶液中,攪拌加熱至50 ℃,保持3 h,得到MNPs-POM1。將MNPs-POM1分散至30 mL 3 mg/mL醋酸溶液中,然后加入GA,攪拌加熱至50 ℃,并保持1 h,得到MNPs-(POM1/CYECS1)。重復(fù)上述自組裝過(guò)程4次,得到多層修飾的MNPs-(POM/CYECS)產(chǎn)物。

1.3 樣品前處理

稱取1 mgβ-酪蛋白樣品,溶解于1 mL 50 mmol/mL碳酸氫銨溶液中,于100 ℃加熱變性10 min,冷卻至室溫,加入20 μL 1 mg/mL胰蛋白酶,于37 ℃水浴條件下酶解16 h,然后在室溫下加入2 μL甲酸終止反應(yīng)。酶解液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 磷酸化肽的富集過(guò)程

將0.5 mg MNPs-(POM/CYECS)加入到100 μL含有肽的緩沖水溶液(50%( v/v)ACN和0.1%(v/v)TFA)中,超聲處理30 min,在外界磁鐵的幫助下分離MNPs-(POM/CYECS)。去除上清液后,用100 μL緩沖溶液洗滌3次。然后用30 μL 5% (v/v)NH3·H2O超聲處理10 min以洗脫捕獲的磷酸化肽,將得到的洗脫液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 MALDI-TOF質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子模式(ESI+);離子源溫度:110 ℃;電噴霧電壓:2.3 kV;掃描范圍:m/z1 000～3 500;毛細(xì)管電壓:3 500 V;碰撞解離能量:10 eV;去溶劑氣體:氮?dú)?去溶劑溫度:200 ℃;去溶劑氣體流速:8 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 MNPs-(POM/CYECS)的表征

2.1.1CYECS的表征

圖1為CYECS制備過(guò)程的示意圖。本實(shí)驗(yàn)首先合成N-PhthCS和ENCS,并用紅外光譜對(duì)CS、N-PhthCS、ENCS和CYECS進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,N-PhthCS和ENCS具有CS的所有特征峰;N-PhthCS在1 715 cm-1和1 770 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,可以歸因于C=O的振動(dòng),證實(shí)了N-Phth的成功引入;ENCS在1275 cm-1處的峰為C-O-C的振動(dòng)峰;與ENCS相比,CYECS光譜中C=O的振動(dòng)強(qiáng)度降低。這些結(jié)果表明已成功合成了CYECS。另外,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了元素分析,結(jié)果表明，CYECS中C、H、N和S的含量分別為47.48%、6.72%、5.95%和3.89%。

2.1.2Gd-POM的表征

已有文獻(xiàn)[15]報(bào)道釓氧化物對(duì)磷酸化肽具有很好的富集效果,因此本工作選用了Gd-POM,并用FT-IR表征Gd-POM的結(jié)構(gòu)特征。在755、850和940 cm-1處分別出現(xiàn)了吸收峰,與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。另外,用XPS對(duì)Gd-POM的元素組成進(jìn)行表征,W 4f、Gd 4d、Gd 3d、O 1s和Na 1s的峰值分別對(duì)應(yīng)35.4、141.6、418.4、530.6和1072.2 eV,表明Gd-POM被成功合成。

2.1.3MNPs-(POM/CYECS)的表征

CYECS和Gd-POM經(jīng)層層自組裝后制備得到MNPs-(POM/CYECS)磁性材料。用XPS對(duì)MNPs進(jìn)行表征,在MNPs的譜圖中,出現(xiàn)了Fe 2p(711.04 eV)和O 1s(532.89 eV)峰,而在MNPs-(POM/CYECS)的譜圖中還出現(xiàn)了W 4f、Si 2p、Gd 4d、C 1s、N 1s和Na 1s峰,表明POM/CYECS殼被成功封裝在MNPs表面上。實(shí)驗(yàn)還采用XRD對(duì)MNPs-(POM/CYECS)進(jìn)行表征,在MNPs-(POM/CYECS)的譜圖中出現(xiàn)了30.27°、35.66°、43.30°、53.58°、57.21°、62.78°的2θ衍射峰,與MNPs的衍射峰吻合,說(shuō)明MNPs的晶體結(jié)構(gòu)在制備過(guò)程中沒(méi)有被破壞。

2.2 MNPs-(POM/CYECS)對(duì)磷酸化肽的富集

實(shí)驗(yàn)考察了MNPs-(POM/CYECS)對(duì)β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能。首先研究和優(yōu)化了富集和解吸條件,確定含50%(v/v) ACN和0.1%(v/v)TFA的水溶液為緩沖溶液，5%(v/v)NH3·H2O為解吸液。在此條件下,比較了富集前和經(jīng)過(guò)MNPs-(POM/CYECS)富集后的磷酸化肽的質(zhì)譜圖(見圖2)。通過(guò)直接分析,大量的非磷酸化肽信號(hào)出現(xiàn)在質(zhì)譜圖中(見圖2a)。經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后,非磷酸化肽的信號(hào)顯著降低,可以明顯觀察到磷酸化肽的信號(hào)(見圖2b)。富集到的磷酸化肽的詳細(xì)序列信息見表1。結(jié)果表明,本工作制備的磁性材料能夠有效捕獲磷酸化肽。相比之下,單獨(dú)的釓酸鹽材料由于具有負(fù)電性,不利于同樣帶負(fù)電的磷酸化肽的吸附[17]。另外,與其他基于殼聚糖的磁性材料相比,本實(shí)驗(yàn)制備的磁性材料對(duì)磷酸化肽具有更高的選擇性和靈敏度[18,19]。

圖 1 CYECS的合成路線Fig. 1 Synthetic scheme of cysteamine hydrochloride-modified chitosan (CYECS)CS: chitosan; N-PhthCS: phthalic anhydride modified chitosan; ENCS: epichlorohydrin modified chitosan.

圖 2 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集(a)前、(b)后的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 2 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) (a) before and (b) after enrichment with polyoxometalate-CYECS magnetic nanoparticles (MNPs-(POM/CYECS)) # Dephosphorylated fragments. Peaks 1-10 indicated phosphopeptides that could be seen in Table 1.

由于復(fù)雜生物樣品中磷酸化肽的濃度較低,因此要求方法具有較高的檢測(cè)靈敏度。為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基于MNPs-(POM/CYECS)富集的MALDI-TOF MS方法的靈敏度,分別選取20、2、0.2和0.02 fmol的β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作為檢測(cè)樣品。結(jié)果表明,當(dāng)β-酪蛋白的濃度為0.02 fmol時(shí),仍可以觀察到具有較強(qiáng)信號(hào)的磷酸化肽。說(shuō)明檢出限低至0.02 fmol,證明本實(shí)驗(yàn)方法具有較高靈敏度。

實(shí)驗(yàn)還考察了MNPs-(POM/CYECS)的使用重復(fù)性。以β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作為檢測(cè)樣品,使用MNPs-(POM/CYECS)20次后，富集后得到磷酸化肽的信號(hào)強(qiáng)度和第1次使用后得到的幾乎無(wú)差別(見圖3),表明該磁性材料具有很好的使用重復(fù)性。

表1β-酪蛋白酶解液經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集得到的磷酸化肽序列信息

Table1Informationoftheenrichedphosphopeptidesfromβ-caseindigestswithMNPs-(POM/CYECS)

No.Observed m/zNumber of phosphorylation sitePeptide sequence11030.51FQ[pS]EEQQQTEDELQDK21155.62[pS][pS]EEKFLR31253.11TVD[Mo]ME[pS]TEVF41466.21TVDME[pS]TEVFTK51561.54RELEELNVPGEIVESL[pS][pS][pS]EE[pS]ITR61943.12DIG[pS]E[pS]TEDQA[Mo]EDIK72061.91FQ[pS]EEQQQTEDELQDK82556.11FQ[pS]EEQQQTEDELQDKIHPF92966.24ELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR103122.14RELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR

Nos. 1-10 were the same as that in Fig. 2.

圖 3 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 3 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) after enrichment with MNPs-(POM/CYECS) Peaks 1-10 and # were the same as that in Fig. 1.

為了考察MNPs-(POM/CYECS)對(duì)磷酸化肽的富集選擇性,選取β-酪蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白的混合物(物質(zhì)的量之比1∶2 000∶2 000)作為分析物。通過(guò)直接分析,沒(méi)有觀察到磷酸化肽的質(zhì)譜峰。然而,經(jīng)MNPs-(POM/CYECS)富集后,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了10條磷酸化肽的信號(hào),證明了此磁性材料對(duì)磷酸化肽的高選擇性富集性能。將本工作與最近報(bào)道的磁性材料進(jìn)行比較,結(jié)果見表2,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的磁性材料對(duì)磷酸化肽具有令人滿意的選擇性及靈敏度。

表 2 本工作與其他報(bào)道的材料的磷酸化肽富集效果的比較Table 2 Comparison of enrichment efficiency of the other materials for phosphopeptides with reported materials

MG@mSiO2-ATP-Ti4+: adenosine phosphate-Ti4+functionalized magnetic mesoporous graphene oxide nanocomposite; Fe3O4@SiO2@(HA/CS)10-Ti4+: titanium phosphate moiety on a multilayer polysaccharide (hyaluronate and chitosan) coated Fe3O4@SiO2nanoparticle; mag GO-CS-Ti4+: Ti4+ions immobilization on crosslinked chitosan loaded on the surface of magnetic graphene oxide; Fe3O4@MIL-101(Fe): metal-organic frameworks shell onto Fe3O4nanoparticles; DFMMOF: dual-metal centered zirconium-organic framework; Fe3O4/PDA/PAMA-Arg: Fe3O4/polydopamine/poly(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride)/arginine; BSA: bovine serum albumin.

3 結(jié)論

本文通過(guò)層層自組裝技術(shù)制備了多金屬氧酸鹽-殼聚糖復(fù)合吸附磁性材料,結(jié)合MALDI-TOF MS檢測(cè)手段,成功用于磷酸化肽的富集。該磁性材料具有快速磁響應(yīng)、親水性、正電性的特點(diǎn),增強(qiáng)了對(duì)磷酸化肽的富集效率和選擇性。本工作不僅提供了一種新型高效富集磷酸化肽的磁性材料,還進(jìn)一步開拓了多金屬氧酸鹽的應(yīng)用領(lǐng)域。