陳宗保，王 星，尹月春，陳國南

(1.上饒師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江西省高等學(xué)校應(yīng)用有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；2.福州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 食品安全分析與檢測(cè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350116)

氟喹諾酮類藥物(FQs)具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、使用方便,以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于獸禽疾病的防治[1]。但此類藥物的不當(dāng)和過量使用所導(dǎo)致的藥物殘留會(huì)危害人體健康，也會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而間接危害人類健康。同時(shí)，氟喹諾酮類藥物也是水產(chǎn)品中一類重要的藥物殘留污染物[2]。因此，對(duì)該類藥物的檢測(cè)具有重要意義。目前，檢測(cè)氟喹諾酮類藥殘的方法有微生物法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3]、毛細(xì)管電泳法(CE)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[8-9]、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)[10]。其中，微生物法及酶聯(lián)免疫法操作簡(jiǎn)單、快速，但靈敏度不高，高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠，但檢測(cè)儀器昂貴，電化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、易于控制等特點(diǎn)。毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用(CE-ECL)技術(shù)則結(jié)合了毛細(xì)管電泳的高效分離和電化學(xué)發(fā)光的高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，成為一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的分離分析技術(shù)[11-12]。目前，利用CE-ECL聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的報(bào)道甚少[13-14]。

本文利用3-巰基-1-丙胺改性納米金粒子，探索新型富集及CE分離技術(shù)。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立了一種基于改性納米金粒子富集結(jié)合CE-ECL技術(shù)對(duì)4種氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)的檢測(cè)方法。該方法具有高效、快速、富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足快速測(cè)定痕量氟喹諾酮類藥物的分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(EN)、氧氟沙星(OF)、諾氟沙星(NOR)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于98%,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；六水合三聯(lián)吡啶氯化釕[Ru(bpy)3Cl2·6H2O]、Tween-80(Aladdin試劑公司)；二硫蘇糖醇(DTT)、3-巰基-1-丙胺(純度為98%，Adamas試劑公司)；Span-80、Triton X-100(分析純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；其它試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

MPI-A型毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)；有效長度為67 cm、內(nèi)徑為50 μm未涂層熔融石英毛細(xì)管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)；TDZ4-WS型離心機(jī)(湖南賽特湘儀廠)；PHS-3C型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)；KQ-100型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，Bedford)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1毛細(xì)管的活化有效長度為67 cm的毛細(xì)管(75 μm×65 cm)分別經(jīng)0.1 mol/L鹽酸、水、0.5 mol/L氫氧化鈉、PBS緩沖溶液各沖洗30 min。每次進(jìn)樣間隔需用電泳緩沖液清洗3 min，每進(jìn)樣5次，依次分別用水、0.5 mol/L氫氧化鈉、水和電泳緩沖液清洗10 min。使用前所有溶液均用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，然后經(jīng)超聲器振蕩以除去溶液中的微小氣泡。

1.2.2納米金的合成及修飾按照Frens的方法[15]合成納米金液：將50.0 mL 2.5×10-4mol/L的 HAuCl4水溶液邊攪拌邊加熱至沸后，一次性加入1.75 mL 10.0 g/L的檸檬酸鈉溶液形成酒紅色，表明得到金納米粒子，繼續(xù)攪拌30 min，放置冷卻至室溫。準(zhǔn)確移取1.0 mL AuNPs溶液，加入適量3-巰基-1-丙胺溶液，過夜后，離心洗滌1～2次，得到改性金納米沉淀，隨后加入25 mmol/L pH 4.0的PBS緩沖溶液，得到改性的納米金溶液。

1.2.3目標(biāo)物的富集及分析分別取4種5.0×10-3mol/L 的FQs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液400 μL于離心管中，用25 mmol/L pH 4.0的PBS緩沖液稀釋至4 mL FQs溶液。將500 μL FQs溶液與500 μL Au溶液混合，其混合液室溫放置1 h后，離心洗滌得沉淀，加入10 μL新制的1 mol/L DTT釋放劑，再懸浮以充分釋放富集的目標(biāo)物，室溫放置20 min后離心洗滌，去除沉淀物，所得上清液上機(jī)分析。

1.2.4樣品處理準(zhǔn)確稱取勻漿成糊狀的鰻魚魚肉10.0 g，加入5.0 g無水硫酸鈉，每次加15.0 mL乙腈，分別提取3次，合并提取液，離心，取上清液至圓底燒瓶。向燒瓶中加入6.0 mL正丙醇，旋干，加入2.0 mL乙腈-水(40∶60)混合液，再加入2.0 mL乙腈飽和正己烷溶液，振蕩均勻，離心分層，取下層液體，用0.22 μm微孔濾膜過濾，待富集后測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集原理及倍數(shù)

納米金粒子具有小粒徑、大比表面積，很高的界面活性等特點(diǎn)，而氟喹諾酮類藥物均具有羧基(—COOH)的特殊結(jié)構(gòu)。為使納米金能較好地富集目標(biāo)物，實(shí)驗(yàn)采用3-巰基-1-丙胺對(duì)納米金進(jìn)行表面修飾，使其帶上氨基(—NH2)，在酸性條件下，修飾有氨基的AuNPs可與帶有羧基的FQs藥物進(jìn)行多位點(diǎn)的氫鍵作用，使之富集聚沉。隨著DTT釋放劑的加入，可使富集的目標(biāo)物游離出來，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的分離檢測(cè)，其示意圖如圖1所示。

圖1 改性納米金富集恩諾沙星的原理圖

2.2 方法的可行性

2.3 ECL檢測(cè)條件的選擇

圖2 緩沖液pH值對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖3 分離電壓對(duì)分離的影響

圖4 緩沖液濃度對(duì)分離的影響

圖5 進(jìn)樣電壓對(duì)發(fā)光強(qiáng)度及分離度的影響

2.4 電泳分離條件的選擇

2.4.1分離電壓的優(yōu)化在毛細(xì)管電泳中進(jìn)行高通量分析檢測(cè)時(shí)，分離電壓對(duì)分析物的檢測(cè)時(shí)效及分離效果有較大影響。在實(shí)際分析中，常采用較高的分離電壓以加快分析速度并提高分離度，但過高的電壓會(huì)對(duì)多組分的分離造成不良影響。因此，實(shí)驗(yàn)考察了10～20 kV范圍內(nèi)不同分離電壓對(duì)分離度及電流值的影響(圖3)。結(jié)果表明，隨著分離電壓的增大，電流和分離度(RS)均呈上升趨勢(shì)，并在分離電壓為14 kV和16 kV時(shí)，4種分析物可實(shí)現(xiàn)有效分離，且分離電壓為16 kV時(shí)，分離度更高，電流值更大。繼續(xù)增大分離電壓時(shí)，分離度下降，而電流信號(hào)雖增加，但基線噪聲信號(hào)增強(qiáng)，不利于分離。故實(shí)驗(yàn)選擇最佳分離電壓為16 kV。

2.4.2緩沖液濃度的優(yōu)化緩沖溶液的濃度由于會(huì)影響緩沖體系的離子強(qiáng)度，從而改變?nèi)苜|(zhì)與管壁之間和被分離組分之間的相互作用，故其影響不可忽視。實(shí)驗(yàn)考察了PBS溶液濃度分別為15、20、25、30、35 mmol/L時(shí)對(duì)電流響應(yīng)值和分離效果的影響(見圖4)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著電泳緩沖液濃度的逐漸增大，電流值平穩(wěn)增加，而分離效果則呈倒“U”型變化，當(dāng)電泳緩沖溶液濃度為20～30 mmol/L時(shí)基線平穩(wěn)，分離效果較好，但當(dāng)電泳緩沖溶液濃度大于25 mmol/L時(shí)，其基線噪聲信號(hào)明顯增強(qiáng)，電泳圖譜峰出現(xiàn)峰刺、展寬現(xiàn)象，故實(shí)驗(yàn)選擇PBS緩沖液的最佳濃度為25 mmol/L。

2.4.3進(jìn)樣時(shí)間及電壓的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)CE-ECL儀器裝置采用可編程的高壓電源(0～20 kV)電動(dòng)進(jìn)樣模式，研究表明，進(jìn)樣量決定性地影響著分離度及檢測(cè)靈敏度?？紤]到延長進(jìn)樣時(shí)間時(shí)，進(jìn)樣量增多，造成組分?jǐn)U散，峰形變寬，分離效率降低，因此實(shí)驗(yàn)固定進(jìn)樣時(shí)間為10 s，考察了不同電動(dòng)進(jìn)樣電壓(6、8、10、12、14、16 kV)對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及分離效率的影響(圖5)。實(shí)驗(yàn)表明，隨著進(jìn)樣電壓的逐漸升高，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)程度由快到慢，而分離度則相反，在進(jìn)樣電壓由低到高的變化過程中，分離度逐漸下降，大于12 kV時(shí)，分離度RS小于1.5,表明無法完全分離。故在控制一定進(jìn)樣量(進(jìn)樣時(shí)間10 s)時(shí),實(shí)驗(yàn)選擇12 kV為最佳進(jìn)樣電壓。

圖6 4種藥物在最優(yōu)條件下的電泳分離譜圖

2.5 富集倍數(shù)

在緩沖溶液pH=3.0～4.0，AuNPs用量1 mL時(shí)，將200 μL 0.5 mmol/L 3-巰基-1-丙胺修飾劑與0.2 mmol/L Triton X-100改性劑用于富集樣品濃度為1.0×10-5mol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，平行測(cè)定3次。結(jié)果表明，CIP、EN、OF、NOR 4種分析物的平均富集倍數(shù)分別為104、127、111和106倍。表明該方法可以提高的靈敏度。

2.6 線性范圍、檢出限及方法精密度

以乙腈與水(3∶7)混合液為稀釋劑，分別將CIP、EN、OF和NOR 4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成一系列濃度(0.05～10 μmol/L)工作液。在最佳條件下富集后，依次進(jìn)行分析檢測(cè)。以峰高(y)對(duì)濃度(x，μmol/L)作圖，分別得到CIP、EN、OF和NOR的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限(LOD)，結(jié)果如表1所示。4種分析物在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.992，以信噪比S/N≥3的濃度計(jì)算其檢出限(LOD),各分析物的LOD均不大于0.05 μmol/L。在最優(yōu)條件下，同1天內(nèi)連續(xù)6次對(duì)不同濃度水平的加標(biāo)鰻魚樣品進(jìn)行CE-ECL分析，依據(jù)CIP、EN、OF、NOR的峰高及保留時(shí)間計(jì)算日內(nèi)平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，4種分析物的峰高RSD均不大于8.3%，保留時(shí)間RSD均小于7.2%。

表1 CIP、EN、OF、NOR的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)及LODsTable 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r) and LODs of CIP,EN,OF and NOR

2.7 樣品分析及回收率實(shí)驗(yàn)

鰻魚樣品經(jīng)“1.2.4”方法處理后，在最優(yōu)條件下，采用改性納米金預(yù)富集方法對(duì)加標(biāo)后的鰻魚提取液進(jìn)行分析，在實(shí)際樣品中未檢測(cè)出4種分析物。在實(shí)際樣品中直接添加兩種水平(20、50 μmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明4種分析物的樣品回收率為94.5%～112%，RSD均不大于6.3%。因此，該方法可用于實(shí)際樣品中4種藥物殘留的同時(shí)檢測(cè)。

表2 鰻魚樣品的回收實(shí)驗(yàn)(n=3)Table 2 Recovery test of the spiked eel sample(n=3)

3 結(jié) 論

本文采用改性納米金顆粒對(duì)4種FQs藥物進(jìn)行富集，結(jié)合CE-ECL檢測(cè)技術(shù)，建立了一種高靈敏分析檢測(cè)FQs藥物的方法。對(duì)富集與分離條件進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，該方法的檢出限可達(dá)0.02 μmol/L，應(yīng)用于實(shí)際鰻魚樣品的檢測(cè)，效果良好。