武太鵬,張京晨,馬 康*

(1.中國計量科學研究院，北京 100029；2.中國石化石油化工科學研究院，北京 100083)

色素作為一類重要的食品添加劑，因能賦予食品靚麗的色彩而被廣泛應(yīng)用。色素主要分為天然色素和合成色素兩類，其中天然色素為天然產(chǎn)物，一般對人體無害，但價格昂貴，穩(wěn)定性差；而合成色素具有成本低、色澤鮮艷、性能穩(wěn)定、色調(diào)多、著色力強、使用方便等特點，因此其應(yīng)用更為廣泛。目前我國允許添加的合成色素主要有檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍等，對其使用范圍和最大限量標準等有明確規(guī)定。而配制酒中允許添加的色素多達37種，其中合成色素有赤蘚紅、靛藍、喹啉黃、亮藍、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、新紅、胭脂紅、誘惑紅[1]。合成色素作為化工產(chǎn)品，大多對人體存在一定的危害，如可能導致過敏或致癌等。因此，為保障食品安全必須對食品所含色素的種類及含量進行準確測定。

目前，針對食品中色素的檢測方法主要有光譜法[2-5]、毛細管電泳法[6-7]、電化學法[8-11]、薄層色譜法[12]、離子遷移譜法[13]、液相色譜法[14-22]以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[23-27]等。其中,液相色譜法因具有樣品用量少、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點而應(yīng)用最多。預調(diào)雞尾酒是近年來興起的一種酒類飲品，目前尚無預調(diào)雞尾酒中色素檢測方法的報道，故建立預調(diào)雞尾酒中色素的快速、高通量、準確測定方法具有重要意義。本文采用固相萃取技術(shù)對預調(diào)雞尾酒進行前處理，通過超高效液相色譜-二極管陣列檢測器(UPLC-DAD)進行檢測，實現(xiàn)了預調(diào)雞尾酒中14種偶氮類色素、4種三苯甲烷類色素、3種氧雜蒽類色素以及萘酚黃S、中性紅、熒光紅共24種水溶性合成色素的快速測定，填補了預調(diào)雞尾酒中色素檢測的空白，為其準確、快速測定提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(美國Thermo公司)；Fotector-06C型全自動固相萃取儀(美國Reeko公司)；XP205型電子天平(精度為0.01 mg)、E20實驗室pH分析儀(瑞士Mettler Toledo公司)；SIGMA 3-18K離心機(德國Sartorius公司)；KQ-300 VDV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Vortex-Genie 2型渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；EVA 32型多功能樣品濃縮儀(普立泰科儀器有限公司)；Milli-Q型超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、亮藍標準溶液來自中國計量科學研究院(NIM)。麗春紅S、萘酚黃S、橙黃G、固綠、橙黃Ⅳ、吖啶黃、堿性橙2、羅丹明B、結(jié)晶紫、亮綠(美國Chem Service公司)；誘惑紅(加拿大Toronto Research Chemicals Inc.)；紅色2G(美國Sigma-Aldrich公司)；偶氮玉紅、胭脂紅SX(日本Tokyo Chemical Industry)；中性紅(美國Damas-Beta公司)；赤蘚紅(波蘭Department of Dyes and Organic Products in Zgierz)，橙黃Ⅱ(美國Acros Organics公司)；熒光紅、酸性紅52(德國Dr.Ehrenstorfer公司)。

乙腈、甲醇、乙酸銨(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Acros Organics公司)；乙酸(色譜純，德國 CNW Technologies GmbH)；氨水(分析純，北京化工廠)；實驗用水由 Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取19種合成色素(除由NIM獲得的5種色素標準溶液)固體粉末適量，溶于水中得質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備溶液。取適量該混合標準溶液與由NIM獲得的5種合成色素標準溶液混合，得質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的24種合成色素混合標準溶液。逐步稀釋，制得0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0、20.0 mg/L的系列混合標準溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品預處理

取15 mL預調(diào)雞尾酒樣品于離心管中，8 000 r/min離心5 min，取上層清液10.0 mL，40 ℃水浴氮吹10 min，以除去樣品中的乙醇。然后置于超聲水浴中超聲10 min，除去樣品中殘留的氣體。靜置10 min后，用水定容至10.0 mL，充分渦旋混勻，以氨水調(diào)至pH 6.5。

對經(jīng)上述處理的預調(diào)雞尾酒樣品進行固相萃取，HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg，Waters公司)依次用5 mL甲醇和5 mL 0.1%(體積分數(shù))甲酸水活化，上樣，調(diào)節(jié)流速為1.0 mL/min，用5 mL甲醇-水(15∶85，體積比)進行淋洗，棄去洗脫液，再分別用3 mL甲醇和3 mL氨化甲醇(5%氨水，體積分數(shù))進行洗脫。45 ℃加熱氮吹至干，以1.0 mL水復溶，待測。

1.4 實驗條件

色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨(pH 6.25)，B為甲醇-乙腈(2∶8，體積比)。梯度洗脫程序：0～12.0 min，4%～50% B；12.0～12.1 min，50%～99% B；12.1～16.5 min，99% B；16.5～17.0 min，99%～4% B。流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相組成本實驗以10 mmol/L乙酸銨(pH 6.25)作為水相，甲醇-乙腈混合溶液作為有機相，考察了甲醇與乙腈的體積比(10∶0、2∶8、4∶6、5∶5、6∶4、8∶2)對24種色素分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著有機相中甲醇比例的增加，24種色素的保留時間均延長，當甲醇與乙腈的體積比為2∶8時可獲得最佳的分離效果；同時，比較了乙酸銨的濃度(5、10、15 mmol/L)和pH值(5.0～6.8)對24種色素分離效果的影響，最終選擇10 mmol/L乙酸銨(pH 6.25)作為水相。

圖1 24種合成色素在不同色譜柱下的色譜圖

2.1.2色譜柱的選擇在相同的流動相條件下，考察了安捷倫Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)、島津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)和Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)3種色譜柱在各自適宜的流速和洗脫梯度下對24種色素的分離效果。結(jié)果顯示，采用安捷倫Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)和島津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)色譜柱時，無法實現(xiàn)24種色素的全部分離，且峰形差，響應(yīng)小(圖1a、b)；而采用Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱時，24種色素可完全分離，峰形對稱且響應(yīng)大(圖1c)，故選其作為分析柱。

2.1.3梯度條件的優(yōu)化由于待測色素種類較多，且其保留行為差異明顯，故采用梯度洗脫以提高分析效率和分離效果?？疾炝?種梯度條件下24種色素的分離效果：梯度1：如“1.4”所示。梯度2：0～15.0 min，5%～65% B；15.0～17.0 min，65% B；17.0～17.1 min，65%～5% B。梯度3：0～8.0 min，5%～40% B；8.0～11.0 min，40% B；11.0～14.0 min，40%～65% B；14.0～17.0 min，65% B；17.0～17.1 min，65%～5% B。梯度4：0～12.0 min，5%～55% B；12.0～12.1 min，55%～90% B；12.1～17.0 min，90% B；17.0～17.5 min，90%～5% B。

結(jié)果表明，采用梯度3時，中性紅和赤蘚紅無法分離，且分析時間較長；采用梯度2時，中性紅和赤蘚紅未完全分離；采用梯度4時，中性紅和赤蘚紅可實現(xiàn)完全分離，但熒光紅和偶氮玉紅的分離度減小，無法基線分離；而采用梯度1時，24種色素均可實現(xiàn)完全分離且分析時間短，故采用梯度1的洗脫程序。

2.1.4檢測波長的選擇待測的偶氮類色素中，檸檬黃、橙黃Ⅱ等分別在420、490 nm附近有最大吸收，其余紅色色素的最大吸收波長均在520 nm附近；三苯甲烷類色素中，除結(jié)晶紫外，其余3種色素的最大吸收波長均在620 nm附近；氧雜蒽類色素的最大吸收波長均在520 nm附近,而萘酚黃S、中性紅、熒光紅的最大吸收波長分別在430、460、490 nm附近。因此實驗選擇在420、490、520、620 nm波長下分別對色素進行檢測(表1)。

在上述最佳條件下，16 min內(nèi)即可實現(xiàn)對24種水溶性合成色素的分離、檢測(圖2)，且所有色素的分離度均大于2(表1)。

表1 24種合成色素的保留時間、檢測波長、線性關(guān)系、分離度、檢出限及定量下限Table 1 Retention times,detection wavelength,linear relationships,resolutions,LODs and LOQs of 24 synthetic colors

圖2 優(yōu)化條件下24種合成色素的色譜圖(5 mg/L)

2.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下，對不同質(zhì)量濃度的24種合成色素混合標準溶液進行測定，分別以峰面積對其質(zhì)量濃度作圖，24種合成色素在0.01～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.998 0。分別以3倍信噪比(S/N=3)確定方法檢出限(LOD)，10倍信噪比確定定量下限(LOQ)，可得該方法對24種合成色素的LOD為0.66～27.78 μg/L，LOQ為2.19～92.59 μg/L(見表1)。

2.3 精密度及加標回收率

通過計算多次測量結(jié)果的相對標準偏差(RSD)對方法的日內(nèi)與日間精密度進行評價。日內(nèi)精密度：采用本方法對0.5、5、10 mg/L的24種合成色素混合標準溶液在1 d內(nèi)連續(xù)測定6次，計算峰面積的RSD；日間精密度：對0.5、5、10 mg/L的24種合成色素混合標準溶液，每天進樣3次，連續(xù)測定5 d，計算峰面積的RSD。結(jié)果表明，方法的日內(nèi)RSD為0.04%～5.3%，日間RSD為0.08%～6.4%(見表2)。

向空白的預調(diào)雞尾酒樣品中添加24種合成色素的混合標準溶液，得到低(0.1 mg/L)、中(0.5 mg/L)、高(1 mg/L)3個水平的基質(zhì)加標溶液，按本方法進行測定，每個加標水平平行處理2個樣品，每個樣品分別測定3次(表2)。結(jié)果表明，在低、中、高3個濃度水平下，除堿性橙2、亮綠和結(jié)晶紫外，21種色素的加標回收率分別為71.2%～114%、72.8%～96.3%、70.6%～109%，RSD分別為0.19%～1.5%、0.40%～4.8%、1.5%～6.0%；而堿性橙2、亮綠和結(jié)晶紫的加標回收率略低(53.4%～72.5%)，RSD為3.3%～8.9%，可能是由于預調(diào)雞尾酒樣品中檸檬酸等成分與這3種色素相結(jié)合，導致固相萃取柱對其的吸附量減少;同時這3種色素均為堿性色素，在酸性條件下與吸附劑的吸附能力較弱，從而使其回收率降低。

表2 方法重復性及回收率Table 2 Reproducibility and recovery of the method

the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

表3 食品中合成色素分析方法的檢出限比較Table 3 Comparison of method detection limits for synthetic pigments in food ρ/(μg·L-1)

*not detected

2.4 實際樣品的檢測

采用所建立方法對市售的10種品牌共50余種預調(diào)雞尾酒進行檢測，結(jié)果表明，除無色(荔枝口味)的預調(diào)雞尾酒樣品外，在其余有色的預調(diào)雞尾酒樣品中均檢出了合成色素，最多的同時檢出3種色素。在所測樣品中共檢出誘惑紅、莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃、亮藍6種合成色素，質(zhì)量濃度分別為2.05～10.62 mg/L、1.82～10.41 mg/L、0.72～3.88 mg/L、0.04～0.87 mg/L、1.74～10.02 mg/L、0.12～3.48 mg/L，檢出的樣品數(shù)分別為9種、18種、8種、23種、10種、28種。雖未發(fā)現(xiàn)違禁使用色素或單種色素超量添加的現(xiàn)象，但目前并未有針對預調(diào)雞尾酒中色素的限量標準，故同時檢出多種色素的預調(diào)雞尾酒的安全性有待驗證。同時發(fā)現(xiàn)，有5種低檔價位、2種中檔價位共20余種樣品存在配料表所標色素與實際添加色素不符的情況。

2.5 本方法與文獻方法的比較

將本方法與已報道的文獻方法[17-22]進行比較。文獻方法可分析的色素為6～16種，分析時間為13～30 min,而本方法在色素數(shù)量、分析時間上具有明顯優(yōu)勢；與文獻[17-19]相比，本方法的分析時間縮短了20%以上。而與文獻[20-22]相比，檸檬黃、莧菜紅等色素的檢出限至少降低了30多倍，文獻[20]、[21]、[22]中對檸檬黃的檢出限分別為150、190、50 μg/L，而本方法對檸檬黃的檢出限為1.09 μg/L(見表3)。

3 結(jié) 論

本文采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，建立了同時測定預調(diào)雞尾酒中24種水溶性合成色素含量的方法。與已報道方法相比，本方法的分析時間縮短了20%以上，且具有分析色素種類多、重現(xiàn)性好、檢出限低等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于50余種預調(diào)雞尾酒實際樣品的測定。