馮穎杰，袁岐山，楊宗燦，張婷婷，劉向真，李成剛，王二彬，馬勝濤，張展

河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南省鄭州市隴海東路72號(hào) 450000

微生物在煙葉的發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要的角色[1-2]，能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化煙葉中的大分子物質(zhì)降解成小分子致香成分，從而改善煙葉品質(zhì)，縮短醇化周期[3]。篩選不同的微生物菌株應(yīng)用于煙葉發(fā)酵已獲得了行業(yè)內(nèi)的普遍認(rèn)可[4]。

多酚類(lèi)物質(zhì)主要包括綠原酸、蕓香苷、莨菪亭等，是煙葉的重要組分，對(duì)于煙葉的色澤、煙香和吃味等指標(biāo)起重要影響[5]。復(fù)烤后煙葉中多酚氧化活性顯著下降[6]，在煙葉自然醇化的過(guò)程中，多酚物質(zhì)的降解十分緩慢[7]。多酚物質(zhì)自身具有澀感，多酚氧化后可與蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生美拉德反應(yīng)生成多種致香組分[8-10]，可使煙香更加豐富，煙氣更為醇和，對(duì)于改善煙葉品質(zhì)具有積極作用[11-12]。因此，開(kāi)發(fā)微生物技術(shù)調(diào)控復(fù)烤后煙葉中多酚物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化，對(duì)于加速煙葉醇化、改善煙葉品質(zhì)具有重要價(jià)值。

鞘氨醇單胞菌是一類(lèi)可降解多環(huán)芳烴和酚類(lèi)物質(zhì)的微生物，可在高度貧營(yíng)養(yǎng)和惡劣條件下存活，分布廣泛[13]，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性，已有報(bào)道鞘氨醇單胞菌可用于生產(chǎn)胡蘿卜素和生物膠等[14-15]。本研究團(tuán)隊(duì)前期從煙葉環(huán)境中分離得到一種可以降解多酚的鞘氨醇單胞菌，命名為Sphingomonassp.XP[16]。本文擬在此基礎(chǔ)上，利用鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp.XP對(duì)煙葉進(jìn)行發(fā)酵處理，研究菌株對(duì)煙葉中多酚物質(zhì)的轉(zhuǎn)化降解作用，為開(kāi)發(fā)適用于改善煙草品質(zhì)的新型微生物技術(shù)提供新的思路和參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

選用2014年復(fù)烤后煙葉，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供（見(jiàn)表1）；

表1 煙葉樣品Tab.1 Tobacco leaf samples

綠原酸（純度≥98%）、咖啡酸（純度≥98%）、3,4-二羥基苯甲酸（純度≥98%）、甲醇（色譜純）均購(gòu)自Sigma；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純或分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CGA培 養(yǎng) 基：Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，綠原酸2.0 g，加無(wú)菌去離子水補(bǔ)足 1 L。

1.2 儀器

Agilent 1200高效液相色譜，配備自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；AutoAnalyzer3連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)Seal公司）；IRAffinity-1紅外光譜儀（日本島津公司）。

1.3 菌株培養(yǎng)

菌液制備：挑取活化培養(yǎng)后的單菌落至250 mL CGA液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 rpm震蕩培養(yǎng)，菌液吸光度 （OD600） 為1.0時(shí)取出，4000 rpm冷凍離心5 min，棄上清液，菌體用200 mL 無(wú)菌水重懸，反復(fù)3次，菌懸液作為發(fā)酵菌液備用，菌液濃度約為2.4×108CFU/mL。

1.4 煙葉發(fā)酵

取500g煙葉樣品，調(diào)整菌液pH為7.0，按照煙葉干重的不同比例噴施菌液，并用無(wú)菌水調(diào)整煙葉水分至25%，反復(fù)摻配，確保菌液在煙葉中分布均勻。以不添加菌液的無(wú)菌水處理煙葉作為對(duì)照組。將處理后的煙葉置于濕度為65%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵，定期取樣分析。

1.5 主要化學(xué)成分檢測(cè)

煙葉中主要多酚物質(zhì)和常規(guī)化學(xué)成分的檢測(cè)參照煙草行業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[17-23]。

1.6 感官評(píng)價(jià)

樣品制備及評(píng)吸方法參照文獻(xiàn)[24-25]方法，采用盲評(píng)的形式，組織10人的評(píng)價(jià)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行對(duì)比評(píng)吸，將對(duì)照樣每項(xiàng)感官評(píng)價(jià)指標(biāo)均設(shè)定為0 分，試驗(yàn)樣品評(píng)價(jià)與對(duì)照樣相比：“+”表示指標(biāo)改善，“－”表示指標(biāo)變差，“0”表示指標(biāo)無(wú)差異；各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均按平均值計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab 16.1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用成對(duì)比較T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)酵樣品組與對(duì)照樣品組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

以河南洛寧上部煙葉K為試驗(yàn)材料，優(yōu)化菌株對(duì)煙葉中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭等主要多酚物質(zhì)降解的發(fā)酵條件。

2.1.1 接種菌液比例的影響

在25 ℃條件下發(fā)酵30 d，考察不同接種量對(duì)煙葉中主要多酚物質(zhì)的變化影響，如圖1所示，與無(wú)菌水（對(duì)照）相比，接菌量的增大使綠原酸和蕓香苷的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，而莨菪亭含量基本保持穩(wěn)定。當(dāng)接種量為煙葉干重的15%時(shí)，綠原酸和蕓香苷含量最低，分別為10.6 mg·g-1和8.0 mg·g-1；增加接種量至20 wt%，綠原酸和蕓香苷含量反而增大。這可能是由于進(jìn)一步提高菌液添加量后，菌株在長(zhǎng)時(shí)間的生存競(jìng)爭(zhēng)中生物量降低，反而不利于多酚物質(zhì)降解。因此，后續(xù)研究中以接種量占煙葉干重的15 wt%。

2.1.2 發(fā)酵溫度的影響

結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)氣溫條件，主要考察了15～30 ℃不同溫度條件下發(fā)酵30 d后煙葉中多酚的變化，結(jié)果如圖2所示。在15 ℃條件下發(fā)酵后，煙葉中的綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量幾乎不變，在20～30 ℃之間，煙葉中的綠原酸和蕓香苷含量隨著發(fā)酵溫度的升高而下降，這可能與菌株在溫度較高的環(huán)境下生長(zhǎng)較快有關(guān)。因此將最佳發(fā)酵溫度定為30 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株降解煙葉中主要多酚物質(zhì)的作用效果如圖3所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸和蕓香苷含量逐漸降低，而莨菪亭含量沒(méi)有明顯的降低。煙葉發(fā)酵30 d后，綠原酸含量由13.3 mg·g-1下降至10.4 mg·g-1，降低21.8%；蕓香苷含量由9.6 mg·g-1下降至7.9 mg·g-1，降低17.7%。繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至36 d，綠原酸和蕓香苷含量降幅較小。因此，將最佳發(fā)酵時(shí)間確定為30 d。

圖1 菌液添加量對(duì)多酚降解的影響Fig.1 Effect of inoculum size of bacteria on the degradation of polyphenols

圖2 溫度對(duì)多酚降解的影響Fig.2 Effect of temperature on the degradation of polyphenols

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多酚降解的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the degradation of polyphenols

2.2 煙葉發(fā)酵效果

為進(jìn)一步驗(yàn)證鞘氨醇單胞菌發(fā)酵對(duì)煙葉的作用效果，本研究對(duì)不同復(fù)烤模塊煙葉進(jìn)行了發(fā)酵處理，并以添加等量無(wú)菌水的煙葉為對(duì)照樣，測(cè)定發(fā)酵前后煙葉中主要多酚物質(zhì)和常規(guī)化學(xué)成分的變化。

2.2.1 主要多酚物質(zhì)的變化

發(fā)酵后各處理煙葉中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭等主要多酚物質(zhì)的含量變化如表2所示。結(jié)果表明：與對(duì)照樣相比，發(fā)酵樣中的綠原酸和蕓香苷含量普遍降低，降解率分別為8～32 %和6～25 %。統(tǒng)計(jì)分析處理組和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌發(fā)酵對(duì)于煙葉中的綠原酸和蕓香苷具有顯著的降解作用，而對(duì)于莨菪亭沒(méi)有顯著的降解作用。不同煙葉中綠原酸和蕓香苷的降低幅度各不相同，這可能是由于不同煙葉表面的微環(huán)境有所差異。

2.2.2 常規(guī)化學(xué)成分變化

發(fā)酵后煙葉中主要常規(guī)化學(xué)成分的變化如表3所示。從表中可以看出，與對(duì)照樣相比，煙葉中的還原糖和總糖含量顯著增加，這對(duì)于提高煙葉品質(zhì)具有有利影響。煙葉發(fā)酵后淀粉含量顯著下降，表明菌株對(duì)淀粉也有降解作用。煙葉發(fā)酵樣中總氮、總植物堿、蛋白質(zhì)等含量沒(méi)有顯著變化，表明菌株不具有明顯的降蛋白質(zhì)和植物堿的功能。

2.2.3 感官質(zhì)量變化

發(fā)酵處理煙葉和對(duì)照煙葉的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯霭l(fā)酵后煙葉與對(duì)照樣品相比感官質(zhì)量總體得分提高，主要表現(xiàn)為香氣質(zhì)和香氣量有所提升，回甜增加，余味干凈舒適。

表2 煙葉主要多酚物質(zhì)含量Tab.2 Content of major polyphenols in tobacco leaves

表3 煙葉常規(guī)化學(xué)成分Tab.3 Content of routine chemical components in tobacco leaves

表4 感官質(zhì)量對(duì)比差異Tab.4 Comparison of smoking quality

3 討論

林麗等[26]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草根、莖、葉本源的微生物菌群進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬為兩大優(yōu)勢(shì)菌之一，這表明鞘氨醇單胞菌屬在煙草中應(yīng)用具備安全性和合理性。但是利用鞘氨醇單胞菌改善煙草品質(zhì)的相關(guān)研究仍基本處于空白。

多酚物質(zhì)與烤煙香氣密切相關(guān)，多酚物質(zhì)的降解有降低復(fù)烤后煙葉苦澀味、增加香氣的效果[27]。然而在自然醇化過(guò)程中，復(fù)烤后煙葉的多酚物質(zhì)降解緩慢。陳頤等[7]探究了不同產(chǎn)地、不同部位片煙醇化過(guò)程中多酚物質(zhì)的變化，結(jié)果表明大部分煙葉在自然醇化的條件下多酚物質(zhì)降低20%～30%，至少需要經(jīng)過(guò)半年或一年的時(shí)間。趙銘欽等[28]通過(guò)控制醇化的高溫高濕環(huán)境增加煙葉多酚的降解率，經(jīng)過(guò)2年時(shí)間的醇化，綠原酸和蕓香苷的降解率最高達(dá)到24%和34%。本研究利用鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp.XP對(duì)復(fù)烤后煙葉發(fā)酵處理，可同時(shí)加速綠原酸和蕓香苷的降解，降解率最高達(dá)到32%和25%，利于有效縮減醇化的時(shí)間，提高效率。

前期研究表明，菌株Sphingomonassp.XP代謝綠原酸的主要中間產(chǎn)物是芳香有機(jī)酸，是重要的香氣前體物質(zhì)[16]。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵處理的煙葉中總糖和還原糖的含量顯著增加，淀粉含量顯著降低。有研究[29]表明鞘氨醇單胞菌可利用淀粉作為碳源。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，鞘氨醇單胞菌對(duì)煙葉中的淀粉有降解作用，導(dǎo)致還原糖含量升高。此外，鞘氨醇單胞菌可能分泌胞外多糖類(lèi)物質(zhì)[30]。因此，經(jīng)發(fā)酵處理后卷煙感官品質(zhì)得到明顯改善。

4 結(jié)論

本研究利用鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp.XP發(fā)酵處理復(fù)烤后煙葉，實(shí)現(xiàn)了煙葉中綠原酸和蕓香苷等多酚物質(zhì)的降解。結(jié)果表明，發(fā)酵處理對(duì)煙葉中綠原酸和蕓香苷具有顯著降解作用，而對(duì)于莨菪亭的降解沒(méi)有顯著作用；發(fā)酵后煙葉總糖、還原糖含量顯著增加；淀粉含量顯著降低，而總氮、總植物堿和蛋白質(zhì)等含量沒(méi)有顯著變化；與對(duì)照組相比發(fā)酵后煙葉感官質(zhì)量提高。本研究為拓展鞘氨醇單胞菌在煙草中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)改善煙葉品質(zhì)的新型生物制劑提供了新的思路。未來(lái)工作中應(yīng)進(jìn)一步探明微生物代謝作用機(jī)理，有效指導(dǎo)和改善煙葉發(fā)酵過(guò)程。