黃婷婷，王靜，符云鵬

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州市文化路95號 450002

煙草在代謝過程中可以生成多種萜類化合物。萜類化合物是由數(shù)個異戊二烯單位構(gòu)成的，根據(jù)數(shù)目不同分為單萜、倍半萜、雙萜、三萜、四萜、多萜等，其中三萜、四萜化合物為初生代謝產(chǎn)物，如甾醇、類胡蘿卜素、赤霉素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯等，是煙草生長發(fā)育所不可缺少的；單萜、倍半萜、雙萜則屬于次生代謝物質(zhì)，與煙草的抗性和品質(zhì)密切相關(guān)[1,2]。大量研究表明，煙草中對煙葉香氣品質(zhì)貢獻較大的萜類化合物主要是單萜、二萜和四萜，其中二萜類化合物如大環(huán)的西柏烷二萜（Cembranoid diterpenes）和雙環(huán)的賴百當二萜（Labdanoid diterpenes）是煙草葉面分泌物中的重要物質(zhì)，對卷煙的煙氣特征和香型有著重要的影響[3-6]。西柏烷二萜普遍存在于普通栽培煙草如烤煙、白肋煙、香料煙等類型煙草中，據(jù)Wagner測定，在TI1608品種中西柏三烯二醇（CBTdiol）的含量約占葉面分泌物總量的60%、葉片干重的10%左右[5]；而賴百當二萜只存在于香料煙和少量的雪茄煙品種中[3,4,7-8]。不同類型煙草中西柏烷二萜和賴百當二萜類物質(zhì)的含量及比例差別很大，這可能是導致不同類型煙草香氣特征具有明顯差異的主要原因之一[7-8]。國內(nèi)外關(guān)于煙草西柏烷二萜代謝及其調(diào)控已有較多研究，并已有相關(guān)文獻綜述[4-6,8-10]，對煙草中賴百當二萜的研究相對較少[7-10]。煙草中賴百當二萜主要有順-冷杉醇（Z-abienol）和賴百當烯二醇（Labdene-diol），順-冷杉醇在煙葉調(diào)制及醇化過程中發(fā)生氧化、降解和轉(zhuǎn)化，其降解產(chǎn)物主要有降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯等具有強烈的龍涎香香氣的物質(zhì)，對增加卷煙香氣和吃味具有重要作用[9,12-14]。因此了解煙草賴百當二萜的合成與代謝途徑及其調(diào)控機制，找到影響該類物質(zhì)的重要基因及關(guān)鍵響應節(jié)點，為今后通過基因工程、代謝工程等手段進行煙草品種改良、香料物質(zhì)生產(chǎn)等提供理論依據(jù)。

1 賴百當二萜的生物合成

1.1 賴百當二萜的生物合成途徑

煙草中賴百當二萜類化合物主要有順-冷杉醇和賴百當烯二醇，二者合成底物相同，均為香葉基香葉基二磷酸（Geranylgeranyl diphosphate, GGPP）[12,15-17]。而GGPP是由異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate, IPP）和其異構(gòu)體二甲基丙烯基二磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP）為前體物形成的[12,17,18]。圖1所示，賴百當二萜的合成首先是GGPP在NtCPS2基因編碼的柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl diphosphate synthases, CPSs）的催化下發(fā)生環(huán)化反應，形成8-羥基-柯巴基焦磷酸（8-α-hydroxycopalyl diphosphate, 8-OH-CPP）；NtABS基因編碼的順-冷杉醇環(huán)化酶以8-OH-CPP為底物合成順-冷杉醇，而8-OH-CPP在賴百當二萜環(huán)化酶（Labdenediol cyclase）的催化下生成賴百當烯二醇，但該途徑的關(guān)鍵基因到目前為止尚未報道[12]。

圖1 賴百當二萜的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of labdane diterpenes

1.2 賴百當二萜合成的品種差異性

Sallaud等[12]對美國農(nóng)業(yè)部煙草種質(zhì)資源庫中不同類型煙草研究發(fā)現(xiàn)，在野生種林煙草中只檢測到西柏烷類化合物西柏三烯二醇；栽培煙草曬黃煙品種Ambalema中只含有賴百當二萜類物質(zhì)順-冷杉醇，栽培煙草品種PI 486352中也只有賴百當二萜類物質(zhì)順-冷杉醇和賴百當烯二醇；PI 119210和香料煙Basma Drama、Izmir中既有西柏烷類又有賴百當二萜類物質(zhì)，其中PI 119210中檢測到西柏三烯二醇、順-冷杉醇和賴百當烯二醇，Basma Drama品種中檢測到較高含量的西柏三烯二醇和順-冷杉醇，Izmir品種中檢測到西柏三烯一醇、西柏三烯二醇和順-冷杉醇。已有的許多報道表明烤煙、白肋煙、馬里蘭煙中一般不存在賴百當二萜類物質(zhì)[4,7,8,12]，但李艷華[19]等人在高香氣烤煙品種豫煙11號中檢測到順-冷杉醇和賴百當烯二醇，該品種具有特殊的香氣。王國平[18]、常愛霞等[20]在特香型烤煙品種大白筋599、革新三號中檢測到冷杉醇，這些特香型烤煙品種為尋找調(diào)控賴百當烯二醇和冷杉醇的關(guān)鍵基因提供了重要的材料。

2 合成賴百當二萜的關(guān)鍵基因

2.1 煙草順-冷杉醇合成關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)

早在上世紀80年代就有煙草中冷杉醇受一個單基因Abl控制并有可能編碼冷杉醇合成的報道[21]，隨后Vontimitta等[22]將該基因定位于煙草A號染色體上。Falara等[23]將NtCPS2基因進行原核表達，該融合表達蛋白經(jīng)脫磷酸化后采用GC-MS分析，結(jié)果表明NtCPS2催化形成了13（E）-labdene-8-ol-15-diphosphate，故推測NtCPS2參與順-冷杉醇的生物合成。直到2012年，冷杉醇首次在裸子植物冷杉屬香脂樹中通過轉(zhuǎn)錄組測序克隆到該基因，并證明該基因編碼的酶同時具有Ⅰ類或Ⅱ類功能活性域[24-27]。同年Sallaud等[12]從香料煙Basma Drama中成功克隆到了NtCPS2和NtABS兩個基因，證實了順-冷杉醇是由NtCPS2和NtABS依次催化合成，并在不含順-冷杉醇的二倍體野生種林煙草中進行了轉(zhuǎn)基因驗證，進一步證明這兩個基因共同編碼冷杉醇的合成。體外酶試驗等發(fā)現(xiàn)，NtCPS2通過捕獲水催化GGPP形成8-OH-CPP，NtABS利用8-OH-CPP為底物合成順-冷杉醇（圖1）[12,18,24,28]。這兩個基因的鑒定方法對賴百當烯二醇等其它賴百當二萜類物質(zhì)合成基因的克隆和驗證提供了借鑒思路。

2.2 順-冷杉醇合成關(guān)鍵基因組織特異性

研究表明，煙草中合成順-冷杉醇的基因NtCPS2和NtABS由腺毛特異性啟動子驅(qū)動，只在腺毛中特異性表達[12,18,29,30]。Sallaud 等[12]從香料煙 Basma Drama中擴增了NtCPS2基因上游1400bp的啟動子序列，連接到含有GUS基因的載體上，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)該段序列能夠驅(qū)動GUS基因在腺毛的分泌細胞中特異性表達；同時采用定量RT-PCR方法，對NtCPS2和NtABS基因在腺毛和葉片中的表達量進行了分析，同時以合成西柏三烯二醇的腺毛特異性表達基因CYP71D16為對照，計算出NtCPS2和NtABS基因在腺毛和葉片中的表達比率分別為116.93和63.64；王國平等[18]研究表明，香料煙Samsun中NtCPS2和NtABS基因在腺毛中的表達量分別是去除腺毛葉片中表達量的800多倍、500多倍，烤煙紅花大金元這兩個基因在腺毛中的表達量分別是去除腺毛葉片中表達量的400多倍、700多倍。上述研究均說明NtCPS2和NtABS基因在腺毛中特異性表達。

2.3 順-冷杉醇合成關(guān)鍵基因的多態(tài)性

Sallaud等[12]研究了不同類型煙草中NtCPS2和NtABS的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生順-冷杉醇和不產(chǎn)生順-冷杉醇煙草品種的NtABS基因cDNA序列沒有差異，但NtCPS2基因cDNA序列存在兩種多態(tài)性，這兩種多態(tài)性都位于NtCPS2基因第4個外顯子的20bp內(nèi)，一個是在第275位堿基位置出現(xiàn)一個8堿基插入序列（INDELCPS2），另一個是在292位堿基上出現(xiàn)了一個SNP 突變位點（SNPCPS2），即由G轉(zhuǎn)變?yōu)門。這兩種突變在同一品種中不共存，并且90%以上品種屬于SNP 突變類型。INDELCPS2導致NtCPS2基因在插入位點下游3個堿基處提前出現(xiàn)終止密碼子，而SNPCPS2導致在突變處產(chǎn)生一個終止密碼子。這兩種突變均造成肽鏈合成提前終止，編碼的蛋白丟失了相應的活性位點，致使其喪失了原有功能。常愛霞等[20]研究了含順-冷杉醇的烤煙品種大白筋599與不含順-冷杉醇的烤煙品種G28、紅花大金元等品種NtCPS2基因的第4個外顯子序列之間的差異，發(fā)現(xiàn)大白筋599的NtCPS2基因第4個外顯子是正常序列，而G28、紅花大金元等品種中NtCPS2基因均在292位堿基處發(fā)生了SNP突變。王國平[18]針對該SNP 位點開發(fā)了兩對鑒定冷杉醇有無的分子標記（1F/R1和8F/R1）用于種質(zhì)鑒定和分子標記輔助選擇育種。

此外，順-冷杉醇的合成只是在轉(zhuǎn)化林煙草中得到驗證，并且只有在同時轉(zhuǎn)化NtCPS2和NtABS時才會表達[12]。王國平[18]等以香料煙Samsun（可合成順-冷杉醇品種）為陽性對照，測定栽培煙草紅花大金元T0代轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)NtABS單基因的陽性植株、轉(zhuǎn)NtCPS2單基因的陽性植株和同時轉(zhuǎn)基因NtABS和NtCPS2的陽性植株，均沒有檢測到順-冷杉醇的合成，分析原因可能是轉(zhuǎn)基因植株中35S啟動子活性不強導致基因表達水平較低，或者存在轉(zhuǎn)基因沉默的問題；同時，對比烤煙紅花大金元基因NtCPS2上游約1500bp序列與香料煙 Basma DramaNtCPS2啟動子序列完全匹配，表明烤煙和香料煙中的NtCPS2極可能是同一個啟動子。這對以后定向改良烤煙冷杉醇合成特性具有重要意義。

3 賴百當二萜的降解與應用

3.1 賴百當二萜與煙草抗病、抗蟲性相關(guān)

有研究表明，賴百當二萜可能與植物抗蟲、抗病性有關(guān)[9,31-35]。Seo等[35]將賴百當二萜類物質(zhì)冷杉醇、硬尾醇分別以100μmol/L濃度施到煙草、番茄和擬南芥根部，能夠誘導抗病基因的表達從而抑制枯萎病發(fā)生；將煙葉中分離的（11E,13E）-賴百當-11,13-二烯-8α,15-二醇（WAF-1）噴灑到煙草葉片上，增強了對煙草TMV侵染的抗性，且WAF-1主要是作為內(nèi)源信號物質(zhì)通過調(diào)節(jié)煙草對TMV侵染的防御反應而起作用的[36]。此外，Vontimitta等[21]以Beinhart1000與Hicks為親本，獲得118株雙單倍體株系群體，構(gòu)建了24個含200個標記位點的連鎖圖譜，并定位到了6個與黑脛病有關(guān)的QTL位點，其中位于4號連鎖群上的黑脛病QTL位點與基因Abl處于同一個位置。William等[37]采用體外試驗表明，順-冷杉醇和有關(guān)二萜的濃度在0.01～100 mg/kg范圍內(nèi)可抑制煙草黑脛病菌菌絲的生長；但在觀察導入合成順-冷杉醇基因的材料中發(fā)現(xiàn)，順-冷杉醇的積累能力與煙株的抗病性沒有關(guān)系，在大田條件下順-冷杉醇對煙草黑脛病的發(fā)病葉沒有影響。因此，目前尚不能說明順-冷杉醇合成基因與煙草黑脛病的抗性有關(guān)。

3.2 賴百當二萜的降解及其在卷煙加香中的應用

賴百當二萜主要存在于香料煙和部分雪茄煙中，主要成分是由葉片腺毛分泌的順-冷杉醇、賴百當烯二醇和硬尾醇等化合物[4,7-9,14]。在煙葉調(diào)制和醇化過程中，絕大部分冷杉醇、硬尾醇和賴百當烯二醇發(fā)生氧化、降解，其降解產(chǎn)物主要是降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯、γ-雙環(huán)同法尼醛和脫氫龍涎香內(nèi)酯，這些化合物都具有強烈的龍涎香香氣，對增加卷煙香吃味有著非常重要的作用[4,38,39]。這幾種化合物有些已在煙草或煙氣中分離鑒定，但也有的因為含量太低，尚未明確鑒定。值得一提的是，圖2中的化合物都具有旋光異構(gòu)體，圖中的異構(gòu)體具有相似的立體構(gòu)型特點，且都具有強烈的杉木香和龍涎香香氣，它們的對映異構(gòu)體則截然不同，香味不明顯，這說明立體構(gòu)型在香味化學中具有重要作用[40]。此外，順-冷杉醇作為琥珀樣龍涎香的半合成前體物，因其優(yōu)美的香氣、良好的定香效果及對煙氣質(zhì)量的影響，被廣泛應用于香料工業(yè)[9,12]。降龍涎醚是賴百當二萜降解產(chǎn)物中作用特別突出的一種香味物質(zhì)，與煙草的特征香韻諧調(diào)和合，并可掩蓋雜氣，即使微量使用，也可改善煙草的香味品質(zhì)，尤其適合混合型卷煙加香[13,15,40]。因降龍涎醚分子量小、揮發(fā)性強、閾值低，應用時多將降龍涎香二醇制備成碳酸酯或草酸酯等潛香物質(zhì)加入到卷煙配方中，在卷煙燃吸過程中均勻釋放降龍涎醚，使卷煙具有較明顯的龍涎香香氣[13,41-43]。

4 展望

煙葉的香氣是限制卷煙質(zhì)量提升的重要因素，特別是隨著卷煙降焦減害的深入發(fā)展，卷煙的香氣量和煙氣濃度難以滿足消費者的需要，對煙葉原料的質(zhì)量提出了更高的要求。改良栽培、調(diào)制措施可以在一定程度上改善煙葉的香氣質(zhì)、提高煙葉的香氣量，但通過生物技術(shù)手段培育新的具有特色香型風格的烤煙新品種，為中式卷煙提供香韻豐富、香氣量充足的特色煙葉原料也是一個重要的途徑。

圖2 順-冷杉醇的降解及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Fig.2 Degradation and product transformation of Z-abienol

香料煙、部分雪茄煙品種及大白筋599、豫煙11號、革新三號等具有特殊香氣的烤煙品種含有順-冷杉醇等賴百當二萜類物質(zhì)[3-5,7,8,12,19,20]。前人研究已經(jīng)證明了香料煙中順-冷杉醇的合成關(guān)鍵基因是NtCPS2和NtABS[12,18,20]，李國平將這兩個基因克隆且導入到烤煙中，結(jié)果轉(zhuǎn)NtCPS2和NtABS基因煙株沒有檢測到順-冷杉醇[18]。常愛霞等[20]研究表明，順-冷杉醇是大白筋599關(guān)鍵致香物質(zhì)，并且明確NtCPS2基因第292 位堿基由G突變?yōu)門是導致生產(chǎn)主栽烤煙品種不含冷杉醇的主要原因。因此，應對含有順-冷杉醇并具有特殊香氣的這類烤煙品種資源的香氣形成機理進行深入解析，進一步研究香料煙順-冷杉醇合成及代謝途徑中關(guān)鍵基因NtCPS2和NtABS的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控機制等，為今后通過分子育種手段快速培育含有順-冷杉醇的、具有特色香氣的煙草新品種具有重要意義。

研究表明，賴百當二萜的降解產(chǎn)物降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯具有強烈的龍涎香香氣，常應用于卷煙工業(yè)的加香加料，微量使用即可掩蓋雜氣，可改善卷煙的香味品質(zhì)[4,12,13,39]。由化學方法生產(chǎn)的的降龍涎香醚因可能存在雜質(zhì)而在香氣特征和安全性方面均不令人滿意[44]。因此，研究賴百當二萜的提取與純化方法，可以利用香料煙等含有賴百當二萜的低次煙葉提取賴百當浸膏，用于卷煙加香，以改善卷煙的香吃味。