周浩，向立剛，陳乾麗，汪漢成，余知和

1 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；

2 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081

漂浮育苗是目前我國(guó)煙草生產(chǎn)采用的主要育苗方式，煙苗生產(chǎn)效率高，長(zhǎng)勢(shì)整齊，易于管理[1-3]。近年來(lái)，隨著育苗大棚的連續(xù)使用及育苗漂盤(pán)的重復(fù)使用，局部煙區(qū)育苗工廠(chǎng)發(fā)生多種苗期病害，如苗期灰霉病[4]、立枯病[5]、根腐病[6]等。此外，苗期長(zhǎng)期低溫寡照，溫室大棚內(nèi)濕度高，育苗基質(zhì)易滋生多種微生物，其中，基質(zhì)上出現(xiàn)苔蘚[7]和腐生真菌較為常見(jiàn)，它們嚴(yán)重影響煙苗的生長(zhǎng)，導(dǎo)致部分煙苗枯死。有關(guān)煙草育苗基質(zhì)上出現(xiàn)腐生真菌尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文對(duì)煙苗漂盤(pán)育苗基質(zhì)上出現(xiàn)的典型腐生真菌進(jìn)行分離，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)其在Biolog FF板上碳源代謝特征進(jìn)行了分析。研究結(jié)果對(duì)了解煙草育苗基質(zhì)腐生真菌的種類(lèi)和指導(dǎo)煙草苗期病害的防治提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3—4 月在貴州省遵義市正安縣斑竹煙葉站育苗大棚內(nèi)，采集典型的帶有腐生真菌的煙苗苗盤(pán)基質(zhì)置于無(wú)菌采樣袋內(nèi)，4℃保存于貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室，待用。

1.2 腐生菌分離

采用組織分離法[8]對(duì)基質(zhì)上典型腐生真菌進(jìn)行分離，樣品于PDA培養(yǎng)基、28℃黑暗下培養(yǎng)3 d，用接種針挑取邊緣的菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，重復(fù)接種三代。將純化的培養(yǎng)物依次編號(hào)，并于4℃下保存。

1.3 腐生菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定將純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基28℃黑暗培養(yǎng)3 d，觀(guān)察菌落形態(tài)；7 d后從平板上挑取少量菌絲進(jìn)行鏡檢，觀(guān)察其菌絲和分生孢子的形態(tài)特征。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將保存的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7 d，從培養(yǎng)皿中刮取菌絲，放入裝有50 μL裂解液（大連寶生物工程有限公司）的離心管中，80℃水浴裂解15 min，取裂解后液體3 μL，采用引物 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì) ITS內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[9-11]。PCR擴(kuò)增體系：Premix Taq（EX Taq version 2.0 plus dye）（大連寶生物工程有限公司） 25 μL，DNA模板 3 μL，引物（ 20μmol/L）各1 μL，去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸105 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后送至上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄該真菌的基因序列信息。用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0中Neighbor-Jioning方法構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 致病性測(cè)定

致病力測(cè)定選用烤煙主栽品種云煙87，煙苗在貴州省煙草科學(xué)研究院溫室內(nèi)培育至兩片子葉。將分離的3株腐生真菌在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d，用直徑8 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌碟，將菌碟1）分別接種于刺過(guò)傷口的煙苗葉片上，2）分別接種于無(wú)傷口的煙苗基質(zhì)上，以未接菌煙苗處理作為對(duì)照。接菌后，將煙苗置于相對(duì)濕度70%、23℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀(guān)察煙苗發(fā)病情況。采集發(fā)生病害的煙苗樣品，采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，并參照1.3.2的方法對(duì)病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.5 碳源代謝特征分析

采用BIOLOG FF 96孔微孔板對(duì)分離所得真菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行其碳源代謝特征分析，按照BIOLOG公司FF的操作指南進(jìn)行碳代謝測(cè)試[12-14]。收集在PDA平板上培養(yǎng)7 d的腐生真菌的分生孢子，用分生孢子調(diào)整接種液的濁度為75% T，將菌懸液倒入V型加樣槽中，移液器將100 μL菌懸液依次加入微孔板所有孔中，28 ℃黑暗培養(yǎng)，96 h后檢測(cè)分離真菌對(duì)95種碳源物質(zhì)的代謝情況。根據(jù)真菌利用95種碳源物質(zhì)進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化、以及微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異進(jìn)行鑒定。獲得真菌的代謝“指紋圖譜”，通過(guò)智能軟件將獲得的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得最大限度的匹配，得出鑒定結(jié)果。根據(jù)鑒定結(jié)果，以菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3為對(duì)象，根據(jù)其在Biolog FF微孔板上96 h后的代謝圖譜，分析腐生真菌對(duì)95種碳源的代謝特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐生真菌分離

經(jīng)組織分離共得到3株菌株，依次編號(hào)為JZ-1、JZ-2和JZ-3，各菌株的菌落形態(tài)如圖1所示。腐生真菌菌株JZ-1、JZ-2及JZ-3在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，2 d即可長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿。初生菌落均為白色，3 d后轉(zhuǎn)為黃綠色，5 d后菌株JZ-1、JZ-2變?yōu)榫G色，菌株JZ-3變?yōu)槟G色。

圖1 菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strains

2.2 腐生菌鑒定

菌株JZ-1和JZ-2的菌絲纖細(xì)無(wú)色，具分隔，多分枝。分生孢子梗叢束疏松，環(huán)狀排列，主分枝呈樹(shù)狀，其上有眾多次級(jí)分枝。分生孢子呈球形、倒卵圓形，大小為2.50～3.75 μm。菌株JZ-3分生孢子梗呈環(huán)狀排列，次級(jí)分枝單個(gè)或以2～3個(gè)為一組，分枝彎曲或波狀。分生孢子呈球形，直徑為2.5～4.8 μm。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，3株真菌均與木霉菌屬Trichoderma真菌形態(tài)類(lèi)似。

引物ITS1F/ITS4從菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3基因組中均擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為600 bp的DNA片段。利用Blast進(jìn)行同源性比較比對(duì)，結(jié)果顯示菌株JZ-1（MG171155）和JZ-2（MG171156）與已報(bào)道的Trichoderma harzianum（KJ000320）同源性達(dá)100%，菌株JZ-3（MG171157）與已報(bào)道的Trichoderma asperellum同源性達(dá)100%（表1）。

表1 腐生真菌的分子生物學(xué)鑒定Tab.1 Molecular identification of saprophytic fungi

3個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。

圖2 腐生真菌JZ-1、JZ-2和JZ-3的ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of saprophytic fungi JZ-1, JZ-2 and JZ-3

綜合形態(tài)學(xué)特征及ITS序列分析結(jié)果，菌株JZ-1和JZ-2被鑒定為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），菌株JZ-3被鑒定為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

2.3 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。葉片創(chuàng)傷接菌10 d后，菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3均可使煙苗發(fā)?。▓D3 B中b、c、d）。發(fā)病部位初呈水漬狀，逐漸擴(kuò)展，病斑褐色，葉片隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)而腐爛，最后煙苗腐爛至死?；|(zhì)接菌10 d后，菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3均未能使煙苗發(fā)?。▓D3 D中b、c、d）。

圖3 腐生菌致病性測(cè)定Fig.3 Determination of the pathogenicity of saprophytic fungi

對(duì)菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3創(chuàng)傷接菌的感病煙苗重新進(jìn)行病原菌分離，得到菌株R-JZ-1、R-JZ-2和R-JZ-3。對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，經(jīng)鑒定，R-JZ-1和R-JZ-2 ITS基因序列與已報(bào)道的Trichoderma harzianum同源性達(dá)100%，菌株R-JZ-3的與已報(bào)道的Trichoderma asperellum同源性達(dá)100%。它們的基因登錄號(hào)分別為MH598839、MH598840和MH598841。

2.4 碳源代謝特征分析

腐生真菌的碳源代謝特征如表2所示。哈茨木霉JZ-2能利用單糖、醇、多糖等59種碳源，有57種碳源能促進(jìn)其產(chǎn)孢，其中，D-纖維二糖、糊精、赤蘚糖醇、D果糖等24種碳源能促進(jìn)該菌株大量產(chǎn)孢。棘孢木霉JZ-3能利用單糖、醇、多糖能利用55種碳源，有53種碳源能促進(jìn)其產(chǎn)孢，其中，N-乙?；??-D-葡萄糖胺、赤蘚糖醇、D果糖、乳果糖、麥芽糖、D-甘露醇、D-甘露醇、D-蜜二糖、α-甲基-D-半乳糖苷、D-山梨醇、D-塔格糖11種碳源能促進(jìn)該菌株大量產(chǎn)孢。菌株JZ-2和JZ-3都能利用的碳源有44種，都無(wú)法利用的有27種。

3 討論

形態(tài)學(xué)特征分析是一種傳統(tǒng)的、基礎(chǔ)的微生物鑒定方法，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察菌絲、孢子和分生孢子梗的形態(tài)來(lái)確定歸屬[15]。真菌ITS序列分析是目前最常用的分子鑒定方法之一，通過(guò)核苷酸序列的同源性比對(duì)來(lái)確定待測(cè)微生物的屬種。Biolog鑒定是基于微生物對(duì)碳源代謝的特征性圖譜來(lái)進(jìn)行鑒定的。本文采用3種方法相結(jié)合的手段對(duì)煙草育苗基質(zhì)中典型腐生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，并對(duì)其碳源代謝特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究結(jié)果對(duì)了解育苗基質(zhì)中腐生真菌的種類(lèi)和指導(dǎo)煙草苗期病害的防治奠定了基礎(chǔ)。

表2 腐生真菌對(duì)Biolog FF 板碳源的利用及其產(chǎn)孢情況Tab.2 Carbon substrate utilization and sporulation of saprophytic fungi on Biolog FF microplate

續(xù)表2

漂浮育苗基質(zhì)是煙草漂浮育苗的核心，除具有支持和固定植株外，更重要的是充當(dāng)中轉(zhuǎn)站的作用，使來(lái)自營(yíng)養(yǎng)液的養(yǎng)分和水分得以中轉(zhuǎn)至煙苗。目前國(guó)內(nèi)外常用的基質(zhì)主要是富含有機(jī)質(zhì)的材料，如草炭或腐熟的植物殘?bào)w等再附加膨脹珍珠巖、蛭石等[2]。育苗基質(zhì)出現(xiàn)菌落可能是基質(zhì)純度和物料腐熟程度不合乎要求，抑或是環(huán)境中微生物利用其豐富的營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)。木霉適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，廣泛存在于自然界土壤、空氣和腐爛植物殘?bào)w等多種基質(zhì)中[16-18]。為此，本文較容易從煙草育苗基質(zhì)中分離獲得木霉菌。據(jù)報(bào)道，木霉菌具有產(chǎn)生抗生素、細(xì)胞壁分解酵素和誘導(dǎo)植物抗性等特性，可用于生物防治、土壤改良、生物肥料等[19]。木霉菌可以適應(yīng)一定范圍的生物脅迫和生理壓力[20-21]。作為生防菌，研究發(fā)現(xiàn)木霉菌具有比一般致病菌更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)和生存能力，在抑制病原菌生長(zhǎng)、尤其在土傳病害的防治中起著重要作用[22]，成為一種很有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的生防菌。莊敬華等人的研究表明生防木霉菌（Trichoderma virideT23）對(duì)甜瓜安全，對(duì)動(dòng)物和環(huán)境無(wú)較大影響[23]。相比而言，本文發(fā)現(xiàn)煙草育苗期，條件合適時(shí)漂盤(pán)基質(zhì)表面出現(xiàn)大量腐生菌木霉，且生長(zhǎng)茂盛，覆蓋育苗基質(zhì)，在煙苗有傷口的情況下可作為致病菌侵染煙苗。由于育苗基質(zhì)中腐生木霉的相關(guān)研究鮮有報(bào)道；為此，煙草育苗基質(zhì)腐生木霉是否影響煙苗的生長(zhǎng)、及如何降低其對(duì)煙苗的危害還有待下一步深入研究。此外，本文僅分離出木霉，在育苗基質(zhì)中的微生物還有很多，下一步有待探究其它微生物的種類(lèi)和作用，為煙草的健康育苗提供基礎(chǔ)。

微生物碳代謝特征能反應(yīng)微生物對(duì)多種碳源的利用情況，本文通過(guò)分析獲得了源自育苗基質(zhì)的腐生木霉對(duì)不同碳源的代謝信息，這些信息為抑制腐生木霉菌的生長(zhǎng)及下一步對(duì)該類(lèi)真菌引起病害的防治提供理論依據(jù)。哈茨木霉和棘孢木霉均能夠利用44種碳源，能促進(jìn)其大量產(chǎn)孢的碳源有赤蘚糖醇、L-海藻糖、乳果糖、麥芽三糖、D-甘露糖、D-松三糖和D-山梨醇；都不能被其利用的碳源有核糖醇、景天庚醛聚糖、蘋(píng)果酸等27種碳源。為此，今后煙草育苗基質(zhì)的選擇，可以考慮選擇富含不能被木霉代謝的載體基質(zhì)。此外，本文獲得木霉菌的碳源代謝信息為今后其生防菌劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中碳源的選擇奠定了基礎(chǔ)。