尚玉坤，劉思凱，陳楊晗，劉 鱺，唐學(xué)博，秦宗志，廖進(jìn)秋

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安625014）

2014年四川省環(huán)保廳和國(guó)土廳聯(lián)合發(fā)布《四川省土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》[1]中指出四川省由于工業(yè)的快速發(fā)展以及農(nóng)業(yè)中化肥的不合理使用，土壤環(huán)境污染狀況形勢(shì)嚴(yán)峻，攀西地區(qū)、成都平原區(qū)和川南地區(qū)等部分地區(qū)土壤重金屬污染問(wèn)題較突出，其中Cd是主要污染物。土壤中的Cd主要來(lái)自成土母質(zhì)，含量范圍一般為0.01～2 mg/kg[2]。土壤中Cd含量增加，嚴(yán)重威脅人們的食品安全。Cd污染地區(qū)種植水稻和小麥等農(nóng)產(chǎn)品的Cd含量容易超標(biāo)[3-4]。當(dāng)Cd2+在植物體內(nèi)富集到一定程度時(shí)，會(huì)影響植物體的生長(zhǎng)，從而使植物表現(xiàn)出植株矮小、生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)量下降等癥狀[5-7]。相關(guān)研究表明：小麥籽粒、花生幼苗和大豆中Cd含量與土壤中Cd含量呈正相關(guān)[8-9]。而大豆不同部位對(duì)Cd的吸收能力存在差異，表現(xiàn)為根＞莖＞葉＞籽粒[10]。

四川省栽培大豆缺乏優(yōu)良種質(zhì)資源，加上無(wú)選擇性的引種，經(jīng)常會(huì)因?yàn)椴贿m宜本地區(qū)的土壤和環(huán)境特征而減產(chǎn)，甚至絕收，給大豆相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。野生大豆是大豆種質(zhì)資源庫(kù)中很重要的組成部分，是栽培大豆的近緣祖先種，常見(jiàn)的栽培大豆有些性狀不能滿足人們的需求，如抗逆性差。而野生大豆在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中形成了較為豐富的變異類型，如攜帶抗病蟲害、抗旱、抗寒、耐鹽堿、結(jié)莢多而密等有利基因，是栽培大豆遺傳育種的重要資源，也是大豆起源、演化、生態(tài)、分類、生理等研究不可多得的育種材料，可以通過(guò)野生大豆資源進(jìn)行栽培品種的遺傳改良[13]。

高等植物可以耐受一定濃度的Cd脅迫，通過(guò)酶促系統(tǒng)降低重金屬對(duì)植物細(xì)胞的損害。例如：低濃度Cd脅迫條件下，玉米幼苗可通過(guò)本身的調(diào)節(jié)機(jī)制，增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)，而高濃度則表現(xiàn)為抑制作用[14]。另外，棉花可以忍受Cd的長(zhǎng)期毒害而不會(huì)大幅度減產(chǎn)，這意味著棉花具有較強(qiáng)的耐鎘脅迫能力[15]。小麥幼苗在Cd脅迫條件下，SOD、CAT均失去活性而POD活性隨處理濃度增加而增加，表明POD積極參與了脅迫條件下活性氧的清除[16]。在逆境下還可以通過(guò)可溶性蛋白滲透調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境的改變，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用[17]。但過(guò)量的Cd會(huì)通過(guò)損傷植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、破壞酶活性、抑制根系生長(zhǎng)、抑制水分和養(yǎng)分的吸收等方式抑制植物生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡[18]。不同植物富集鎘的能力不同[19]，不同植物對(duì)鎘脅迫的耐受能力差異較大[20-21]，大豆是我國(guó)居民日常生活中食用油和蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，在農(nóng)作物中具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是會(huì)在籽粒中積累Cd[22]。因此，研究大豆耐Cd脅迫能力，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

野生大豆是大豆種質(zhì)資源優(yōu)良的基因庫(kù)[23-24]，不同大豆品種耐鎘差異及抗鎘毒害效應(yīng)差異較大。例如，Cd處理?xiàng)l件下，綜合考慮相對(duì)生物量和籽粒干重指標(biāo)，桂夏豆2號(hào)、巴西3號(hào)是耐性品種。相同Cd脅迫條件下巴西10號(hào)、福豆234、華夏4號(hào)和中黃24表現(xiàn)出對(duì)Cd脅迫較為敏感的特征[25]。2.50 mg/L Cd脅迫條件下，湘春豆13、沔1101大豆株高及生物產(chǎn)量比對(duì)照組下降較少，是抗Cd脅迫能力較強(qiáng)的品種[26]。盡管如此，仍有很多優(yōu)良基因還未被發(fā)掘。因此，對(duì)野生大豆進(jìn)行研究，對(duì)合理的利用和保護(hù)野大豆基因資源具有非常重要的意義[27]。本試驗(yàn)采用的野生大豆采自山東省東營(yíng)市的鹽堿地，生存環(huán)境惡劣。為評(píng)價(jià)該野生大豆種質(zhì)資源的耐鎘能力，通過(guò)在不同濃度Cd脅迫條件下，對(duì)野生大豆的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、丙二醛（MDA）及可溶性蛋白（soluble protein）含量的變化情況進(jìn)行測(cè)定，以期為四川地區(qū)鎘污染土壤栽培大豆的安全生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東東營(yíng)（東經(jīng)118°5'，北緯38°15'）野生大豆。

1.2 試驗(yàn)方法

挑選飽滿、成熟度一致的東營(yíng)野生大豆種子，用砂紙摩擦破皮后，用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，用去離子水反復(fù)沖洗，再將種子放入去離子水中于25℃恒溫培養(yǎng)箱中浸種12 h。然后播種于標(biāo)準(zhǔn)大培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿播種50顆，置于光照培養(yǎng)箱（MLR-352H-PC，日本松下）（光照14 h，溫度25.0℃，黑暗10 h，溫度20.0℃、濕度65%）至展開(kāi)一對(duì)子葉。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至裝滿蛭石的圓柱形塑料桶（直徑28 cm、深17 cm）中，每桶4株于植物培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度350μmol/（m2·s），光照時(shí)間12 h；晝、夜溫度分別為25.0℃和20.0℃；相對(duì)濕度65%～70%。利用營(yíng)養(yǎng)液1/2 Hoagland配制Cd2+處理溶液：0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L。每3天定期向每桶注入500 mL的Cd2+處理溶液，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)。在Cd脅迫處理45天時(shí)開(kāi)始收集樣品，之后每隔7天收集一次樣品，連續(xù)收集4 w。采集東營(yíng)野生大豆頂端倒數(shù)第5、6、7片長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，去葉脈后約0.5 g，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

每個(gè)處理取0.5 g新鮮葉片于預(yù)冷的研缽中，加2 mL磷酸緩沖液研磨成漿，加緩沖液使終體積為10 mL，于10 000 r/min下離心10 min，上清液即為提取液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[28]，以抑制NBT光還原的50%為1個(gè)酶活性單位（U/min·g）。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[29]，以每分鐘內(nèi)A470變化0.1為1個(gè)酶活性單位（U/min·g）。SOD和POD均采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)（日本，島津，UV-1760）檢測(cè)。

CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法[30]，以每分鐘內(nèi)A240減少0.1為1個(gè)酶活單位（U/min·g）。可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[31]。丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[32]，稱取不同處理濃度的野生大豆鮮葉1 g于預(yù)冷的研缽中，加入2mL 10%TCA研磨至勻漿，再加8mL TCA進(jìn)一步研磨，于4 000 r/min離心10 min，上清為樣品。4℃下保存?zhèn)溆?。以上?shù)據(jù)均采用雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（A560型，翱藝，UTA13L0006）進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Microsoft Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 9進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及圖表制作，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采取Duncan's multiple angetest法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)野生大豆葉片抗氧化酶活性的影響

當(dāng)用Cd處理濃度分別為0.5、2.0、4.0和8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第45天時(shí)，野生大豆SOD活性顯著增加了12.7%，43.3%、49.0%、49.7%。當(dāng)Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第52天時(shí)，SOD活性顯著增加了10.5%、43.1%、46.7%、45.2%。當(dāng)Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第59天時(shí)，SOD活性顯著增加了11.6%、16.0%、56.5%、62.1%、57.1%。當(dāng)Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第66天時(shí)，SOD活性顯著增加了12.7%、17.1%、46.9%、49.8%、41.7%。當(dāng)Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時(shí)，野生大豆各個(gè)處理時(shí)間段的SOD活性相比于對(duì)照分別顯著性降低了20.7%、14.7%、17.3%、26.2%。在不同濃度Cd處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性均呈顯著性增加的趨勢(shì)（見(jiàn)表1）。

當(dāng)用含Cd濃度為4.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第45天時(shí)，POD的活性顯著增加了31.2%；當(dāng)用含Cd濃度為2.0、8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第66天時(shí)，POD的活性顯著降低了27.3%，24.8%。當(dāng)Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時(shí)，野生大豆各個(gè)處理時(shí)間段的POD活性相比于對(duì)照分別顯著性降低了30.0%、44.2%、53.3%、44.5%。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)Cd處理濃度為1.0 mg/L時(shí)，POD的活性相比于對(duì)照有顯著性增加，而當(dāng)Cd處理濃度分別為0.25、0.5、8.0、16.0 mg/L時(shí)，POD的活性相比于對(duì)照都沒(méi)有顯著性變化（見(jiàn)表2）。

表1 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片SOD活性Table 1 SOD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

表2 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片POD活性Table 2 POD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第45天時(shí)，CAT活性顯著增加了50.3%、41.2%、93.9%、77.6%。當(dāng)用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第52天時(shí)，CAT活性顯著增加了28.0%、42.9%、77.4%、93.5%、89.3%；當(dāng)用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第59天時(shí)，CAT活性顯著增加了31.5%，41.5%、72.5%、81.5%、4.5%。當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第66天時(shí)，CAT活性顯著增加了26.8%、24.7%、46.8%、46.8%，而當(dāng)Cd濃度為16.0 mg/L時(shí)，CAT活性顯著降低了13.6%。當(dāng)Cd處理濃度為16.0 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)CAT活性呈先顯著降低再顯著增加的趨勢(shì)，而其他處理濃度則呈顯著性增加的趨勢(shì)，如表3所示。

表3 不同濃度鎘脅迫下野生大豆CAT活性Table 3 CAT activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

2.2 Cd2+對(duì)野生大豆葉片丙二醛含量的影響

當(dāng)用Cd濃度為8.0和16.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第45天時(shí)，MDA含量顯著增加了21.8%、37.1%。當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0、8.0和16.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第52天時(shí)，MDA含量顯著增加了6.5%、9.5%、14.9%、18.5%。當(dāng)用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第59天時(shí)，MDA含量顯著增加了16.4%、22.2%、31.6 %；當(dāng)用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第66天時(shí)，MDA含量顯著增加了18.2%、22.2%、48.3%，而當(dāng)Cd處理濃度為0.25和0.5 mg/L時(shí)，MDA含量顯著降低了10.2%、9.7%（見(jiàn)圖1A）。當(dāng)Cd處理濃度為0、4.0 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量呈顯著增加的趨勢(shì)。當(dāng)Cd處理濃度為0.25、0.5 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量呈顯著降低的趨勢(shì)。當(dāng)Cd處理濃度為1.0 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量呈先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)。當(dāng)Cd濃度為16.0 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量呈先顯著降低后顯著增加的趨勢(shì)（見(jiàn)圖1B）。

2.3 Cd2+對(duì)野生大豆葉片可溶性蛋白含量的影響

當(dāng)用Cd濃度為4.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第45天時(shí)，可溶性蛋白含量顯著增加了76.2%，而Cd處理濃度為0.5和16.0 mg/L時(shí)，可溶性蛋白含量顯著降低了4.8%、11.9%。當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0和4.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第52天時(shí)，可溶性蛋白含量顯著增加了23.5%、28.4%、64.2%，而Cd處理濃度為16.0 mg/L時(shí)，可溶性蛋白含量顯著降低了16.0%。當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第59天時(shí)，可溶性蛋白含量顯著增加了26.0%、27.3%、92.2%、18.2%。當(dāng)用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗第66天時(shí)，可溶性蛋白含量顯著增加了15.9%、14.6%、84.1%、13.4%（見(jiàn)圖2A）。當(dāng)Cd處理濃度大于等于1.0 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)可溶性蛋白含量沒(méi)有顯著性變化。當(dāng)Cd處理濃度為0和0.25 mg/L時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)可溶性蛋白含量呈顯著性降低的趨勢(shì)（見(jiàn)圖2B）。

3 討論與結(jié)論

Cd是植物的非必需元素，土壤或水體中過(guò)量的Cd被植物吸收后會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一系列的毒害作用[33]。正常情況下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)影響植物正常生長(zhǎng)。受Cd2+脅迫后，活性氧在植物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致植物體的自由基代謝失衡，產(chǎn)生諸如O2-（超氧陰離子）和H2O2等大量活性氧[34]。O2-和H2O2的積累能夠氧化生物分子，打破活性氧代謝平衡導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。丙二醛則是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，它的積累能夠反映植物體內(nèi)自由基的活動(dòng)狀態(tài)，其含量越高反應(yīng)植物膜脂過(guò)氧化程度越高[35]。本研究中，隨著Cd處理濃度的增加，MDA的含量呈顯著增加的趨勢(shì)，表明野生大豆植物體內(nèi)活性氧大量積累，并激活了植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗氧化酶活性發(fā)生了改變[36-37]。

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)存在的一組有效清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)。SOD、POD、CAT這3種酶活性峰值所對(duì)應(yīng)的處理時(shí)間和濃度不同，說(shuō)明它們通過(guò)不同的耐脅迫機(jī)理共同協(xié)作清除植物體內(nèi)氧化物，減輕不利的生長(zhǎng)條件下帶來(lái)的氧化傷害[38]。SOD能夠催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，POD和CAT能夠?qū)2O2分解為無(wú)毒的水，三者共同作用能夠在一定程度上緩解或防御鎘脅迫的傷害，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和防御活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害有重要作用[39-40]。本試驗(yàn)中，當(dāng)Cd濃度小于等于8.0 mg/L時(shí)，SOD、CAT活性升高，這與棉花、擬南芥等作物在Cd2+脅迫下的反應(yīng)一致[41-42]。盡管在該濃度范圍內(nèi)MDA含量增加，但受SOD、POD、CAT的保護(hù)作用，降低了植物受到的過(guò)氧化損傷。在東營(yíng)野生大豆抗氧化酶系統(tǒng)中可能主要由SOD和CAT清除活性氧帶來(lái)的傷害，POD起輔助作用，此調(diào)節(jié)機(jī)制能使植物適應(yīng)并抵抗一定程度的傷害。

圖1 鎘脅迫下野生大豆的MDA含量Figure 1 The MDA content of wild soybean under Cd stress

重金屬離子進(jìn)入植物體后，與其他化合物結(jié)合成金屬絡(luò)合物或螯合物，抑制植物各種代謝活動(dòng)尤其是蛋白質(zhì)的合成。因此，可溶性蛋白質(zhì)含量是衡量植物是否發(fā)生重金屬脅迫的重要指標(biāo)[43]。低濃度的Cd溶液會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白含量增加，而可溶蛋白質(zhì)含量的提高很可能是植物抵抗鎘毒害的一種解毒機(jī)制，例如鎘能誘導(dǎo)產(chǎn)生鎘結(jié)合蛋白，而降低鎘的毒性。可溶蛋白質(zhì)含量的提高，還會(huì)增加細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細(xì)胞正常代謝[44]。本研究中，當(dāng)Cd濃度小于等于8.0 mg/L時(shí)，可溶性蛋白含量呈顯著增加的趨勢(shì)，表明東營(yíng)野生大豆緩解了Cd脅迫帶來(lái)的不利影響，降低了Cd脅迫帶來(lái)的危害。

當(dāng)Cd處理濃度為16.0 mg/L時(shí)，SOD、POD、CAT活性顯著低于對(duì)照，MDA含量升高，可溶性蛋白含量降低，說(shuō)明在此濃度處理下植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡被打破，活性氧自由基大量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化加劇，野生大豆的抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)受到損傷[45-46]。高濃度Cd會(huì)加速原有蛋白質(zhì)的分解以及破壞合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器抑制蛋白質(zhì)合成從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[47]。在該濃度條件下，可溶性蛋白含量顯著降低表明野生大豆中Cd進(jìn)入細(xì)胞后很可能促進(jìn)了蛋白水解酶的活性，加強(qiáng)了原有蛋白質(zhì)分解，或者使蛋白質(zhì)合成的相關(guān)細(xì)胞器受到損傷，抑制了新蛋白的合成[48]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)Cd處理濃度為16.0 mg/L時(shí)，野生大豆無(wú)法通過(guò)自身調(diào)節(jié)抵消Cd脅迫帶來(lái)的危害，生長(zhǎng)明顯受到抑制。

圖2 鎘脅迫下野生大豆的可溶性蛋白含量Figure 2 The soluble protein content of wild soybean under Cd stress

綜上所述，當(dāng)Cd脅迫濃度小于等于8.0 mg/L時(shí)，野生大豆植株通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)以及可溶性蛋白含量的變化防御不同濃度鎘脅迫帶來(lái)的氧化傷害，減輕或緩解鎘脅迫帶來(lái)的不利影響，東營(yíng)野生大豆能正常生長(zhǎng)。東營(yíng)野生大豆為抗Cd能力較強(qiáng)的種質(zhì)資源。利用東營(yíng)野生大豆優(yōu)良基因資源，可豐富生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中的大豆基因庫(kù)，為四川地區(qū)栽培大豆在鎘污染地區(qū)的安全生產(chǎn)提供種質(zhì)資源。