劉柄良，楊 琳，，付鳳玲，李晚忱，張君誠(chéng)，于好強(qiáng)*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所/農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130；2.三明學(xué)院，福建 三明365000）

金線蓮（Anoectochilus）屬于蘭科開唇蘭屬，是多年生草本植物，俗稱金線蘭、金錢草或金草等，主要分布在福建、臺(tái)灣、廣東等亞熱帶及熱帶地區(qū)。從亞洲熱帶地區(qū)至大洋洲大約分布有40余種，我國(guó)有20個(gè)種，2個(gè)變種[1]，其中福建金線蓮（Anoectochilus roxburghii）和臺(tái)灣金線蓮（Anoectochilus formasanus）是我國(guó)最具藥用價(jià)值的2個(gè)近緣種[2]，其主要藥用功效是涼血祛風(fēng)，除濕解毒。由于金線蓮具有株型小巧，葉型優(yōu)美，墨綠色葉面鑲嵌的金色葉脈呈網(wǎng)狀排列等優(yōu)美外觀，所以近年來(lái)被作為觀賞植物加以開發(fā)利用。由于金線蓮自然繁殖率極低，加上人工盲目采挖，已造成野生金線蓮瀕臨滅絕，福建金線蓮已于1990年納入《瀕危野生動(dòng)植物物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES 2003）和《中國(guó)物種紅色名錄》（CSRL2004）[3]。金線蓮不同品種存在明顯表型差異，例如，福建金線蓮葉脈呈金色[4]，臺(tái)灣金線蓮葉脈呈白色，也被叫作銀線蓮[5]。隨著研究的深入，金線蓮的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值日漸提升，成為一方經(jīng)濟(jì)的主要產(chǎn)業(yè)之一。

金線蓮的藥用和保健成分除了黃酮類和多糖類外，辣椒紅素/玉紅素也是其中之一。辣椒紅素/玉紅素是一種四萜類天然色素，屬于類胡蘿卜素，不僅影響金線蓮的觀賞價(jià)值，也具有較好的保健和生物藥效[6]，比番茄紅素更利于人體吸收利用[7]，是清除自由基的一種重要抗氧化物質(zhì)。研究表明，辣椒紅素/玉紅素合酶（capsanthin/capsorubin synthase，CCS）在辣椒紅素合成的最后階段催化辣椒紅素-5，6-環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化為辣椒紅素/玉紅素，是辣椒紅素/玉紅素合成的限速酶之一[8-9]。

J.Deruere等[10]在1994年首次從辣椒中克隆到CCS基因，并證明是其為單拷貝。隨后，Z.Jekni等[11]在2012年從百合屬的植物中也克隆到CCS基因，并證明其在改變植物顏色方面起著重要作用。S.H.Ha等[12]從辣椒中克隆到CCS基因啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其是一個(gè)組成型啟動(dòng)子。M.H.Kumagai等[13]將CCS基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的辣椒紅素含量占類胡蘿卜素總量的36%。而后，Lang Y.Q.等[14]將橙色辣椒與紅色辣椒雜交，對(duì)分離群體的CCS擴(kuò)增檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CCS下游區(qū)域是保守的，橙色辣椒成熟期不能轉(zhuǎn)紅的原因是由于CCS基因上游區(qū)缺失造成的。S.Jeknic等[15]將百合的CCS基因轉(zhuǎn)入番茄中，發(fā)現(xiàn)CCS基因的超表達(dá)可以使番茄果實(shí)顏色發(fā)生較大的改變。此外，CCS基因的表達(dá)顯著受到不同光質(zhì)和鹽脅迫誘導(dǎo)[16-18]；這些結(jié)果均表明CCS在調(diào)控植物顏色方面起關(guān)鍵作用。

本研究通過克隆福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮的CCS基因，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用熒光定量PCR技術(shù)研究其在金線蓮不同組織，及鹽脅迫、紫外和紅光誘導(dǎo)下的相對(duì)表達(dá)水平。以明確福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮CCS基因的序列特征和表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究CCS基因功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮，均購(gòu)于葉之典金線蓮生物科技有限公司。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

將金線蓮組培苗移植在裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆里，放置在25℃（晝）/20℃（夜）、相對(duì)濕度60%～70%和光照200μmol/（m2·s）（14 h）/黑暗（10 h）的光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，生長(zhǎng)18 w后，取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗取根、莖、葉，液氮速凍并于-70℃保存。將其余幼苗隨機(jī)分為3組，第1組轉(zhuǎn)移至帶孔的塑料泡沫板上，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5 d后進(jìn)行鹽脅迫（100 mmol/L NaCl）處理；第2組進(jìn)行紫外光照射處理（波長(zhǎng)253.7 nm）；第3組進(jìn)行紅光照射處理（波長(zhǎng)650 nm）。分別于處理前（0 h，空白對(duì)照）及處理后0.5、1、2、4、8、12和24 h，取葉片，液氮速凍-70℃保存，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。以Trizol法提取各樣品總RNA，再用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TakaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 辣椒紅素合成酶基因（CCS）開放閱讀框的克隆

根據(jù)臺(tái)灣金線蓮的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選獲得CCS基因的編碼序列，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CCS基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）的擴(kuò)增引物，上游引物為:5′-ATGAGCTCCTCCACGATCCT-3′，下游引物為:5′-TCAGGCGTGCTGCTGGTAG-3′。以空白對(duì)照的cDNA作模板，用高保真酶Prime STAR HS DNA polymerase（TakaRa，大連）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增總體系25μL:cDNA 1μL，5×Buffer 5μL，dNTP mix 2μL，PrimeSTAR高保真酶0.3μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 15.7μL反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min；之后按95℃變性30 s，61.5℃退火30 s，72℃延伸1.5 min擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，以1.5%瓊脂糖凝膠在120 V電壓下，電泳30 min。通過凝膠成像檢測(cè)目標(biāo)條帶，并利用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，并進(jìn)行3′端加腺嘌呤反應(yīng)，連接至pMD19-T載體。挑取陽(yáng)性單克隆，菌液檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆并送上海生物工程公司測(cè)序。

1.4 CCS基因的生物信息學(xué)分析

用EXPASY在線數(shù)據(jù)（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)CCS基因的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，使用GOR IV（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）對(duì)CCS基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]；通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對(duì)CCS基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/wolfpsort.html）對(duì)CCS基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。下載已知植物的CCS氨基酸序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行CCS氨基酸序列的多序列比對(duì)，通過MEGA7.0工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]。

1.5 金線蓮CCS基因表達(dá)分析

以Primer5.0設(shè)計(jì)CCS基因的定量PCR檢測(cè)引物（表1），各樣品cDNA作為模板，參考Zhang G.等[21]的研究，以持家基因Actin作內(nèi)參。用SYBR Green法在Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)CCS基因的表達(dá)量；反應(yīng)總體系為10μL:cDNA 1μL，SYBR Green I染料(TakaRa，大連)5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，ddH2O 3.2μL；反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 s，然后按95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，延伸結(jié)束收集熒光，46個(gè)循環(huán)；之后從50℃開始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每個(gè)溫度保持5 s。最后用2-△△Ct法計(jì)算各樣品中CCS基因的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行顯著性分析。

表1 熒光定量PCR設(shè)計(jì)和使用的引物Table 1 The primers of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 CCS基因的ORF序列

以空白對(duì)照的cDNA為模板，用方法2.3中設(shè)計(jì)的ORF擴(kuò)增引物擴(kuò)增CCS的ORF。測(cè)序及分析結(jié)果表明，福建金線蓮CCS基因的ORF全長(zhǎng)1 461 bp，編碼486個(gè)氨基酸；臺(tái)灣金線蓮CCS基因的ORF全長(zhǎng)1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸（圖1），分別命名為ArCCS和AfCCS。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ArCCS與AfCCS編碼的氨基酸序列相似度高達(dá)97%，二者共有14個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同，序列長(zhǎng)度上僅相差一個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 CCS基因ORF擴(kuò)增片段Figure 1 The ORF fragments of CCS gene

2.2 CCS蛋白序列特征

利用ExPASy在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CCS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ArCCS蛋白質(zhì)分子式為C2381H3707N667O672S33，相對(duì)分子質(zhì)量為53 kD，等電點(diǎn)pI7.57，不穩(wěn)定系數(shù)為56.88（＞40），親水系數(shù)為-0.061（＜0）。AfCCS蛋白的分子式為C2382H3713N671O670S32，相對(duì)分子質(zhì)量為53 kD，等電點(diǎn)pI 8.34，不穩(wěn)定系數(shù)為55.06（＞40），親水系數(shù)為-0.080（＜0）。說(shuō)明兩種金線蓮CCS蛋白理化性質(zhì)相似，均為不穩(wěn)定的親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ArCCS蛋白的氨基酸序列中α-螺旋占37.86%，伸展鏈占15.43%，無(wú)規(guī)則卷曲占46.71%。AfCCS蛋白的氨基酸序列中α-螺旋占39.38%，伸展鏈占16.08%，無(wú)規(guī)則卷曲占44.54%。二者的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型也高度相似，且二者均定位于葉綠體。進(jìn)化分析結(jié)果表明，ArCCS與AfCCS蛋白與百合屬的CCS蛋白相似性最高且進(jìn)化關(guān)系更近，與蘋果、梨CCS蛋白的相似度及進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3），表明我們克隆到的基因序列的確是金線蓮的CCS基因。

2.3 CCS基因表達(dá)特性

qRT-PCR結(jié)果表明，ArCCS基因的表達(dá)無(wú)組織特異性，在根、莖、葉中的表達(dá)無(wú)顯著差異。然而，AfCCS基因的表達(dá)存在顯著的組織差異性，其在根中表達(dá)最低，莖中表達(dá)最高，與葉中的表達(dá)相比，差異達(dá)到極顯著水平（圖4）。

圖2 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Figure 2 The results of amino acid sequence alignment

圖3 不同物種CCS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 The phylogenetic tree of the CCS proteins from different species

對(duì)處理后的樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)表明，ArCCS基因的表達(dá)在鹽脅迫后表達(dá)量先升高，在1 h達(dá)到最高，隨后被抑制表達(dá)，在24 h其表達(dá)量達(dá)到最低。AfCCS基因表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，處理后其相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照，處理后12 h其表達(dá)量達(dá)到最高（圖5）。但是，紫外處理后二者的表達(dá)模式與鹽脅迫處理后的表達(dá)模式相反，ArCCS基因表達(dá)受到紫外的誘導(dǎo)極顯著高表達(dá)，而AfCCS基因被紫外抑制下調(diào)表達(dá)（圖6）。在650 nm紅光處理0.5 h，ArCCS基因表達(dá)量達(dá)到峰值且極顯著高于對(duì)照（圖7），說(shuō)明ArCCS基因比AfCCS基因?qū)h(yuǎn)紅光的響應(yīng)更迅速。

3 討論與結(jié)論

福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮的CCS基因序列相似度高達(dá)97%，二者長(zhǎng)度上僅相差1個(gè)甘氨酸（圖2），我們推測(cè)這正是2個(gè)蛋白具有相似理化性質(zhì)和空間折疊模型的原因。但研究結(jié)果顯示二者在不同組織器官的表達(dá)特性以及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)存在顯著差異；AfCCS基因主要在莖中表達(dá)，在根中幾乎不表達(dá)；ArCCS基因在根、莖、葉中的表達(dá)無(wú)顯著差異，無(wú)組織特異性；ArCCS基因和AfCCS基因的表達(dá)均受到鹽脅和不同光質(zhì)的誘導(dǎo)或抑制，且差異達(dá)到顯著或極顯著水平；說(shuō)明ArCCS與AfCCS基因表達(dá)受不同順式作用元件調(diào)控，推測(cè)二者的啟動(dòng)子區(qū)域可能存在顯著差異。已有研究表明，CCS基因在百合、辣椒、紐荷爾臍橙等物種中表達(dá)特性也存在顯著的時(shí)空差異性或受環(huán)境因素的顯著影響[11，18，22-23]。CCS基因編碼辣椒素合成酶，催化合成辣椒紅素且與植物顏色緊密相關(guān)，CCS基因表達(dá)量越高，則辣椒紅素積累越多，植株顏色越紅[11，22-23]。福建金線蓮葉脈表現(xiàn)金色、莖桿淡綠，而臺(tái)灣金線蓮葉脈呈現(xiàn)銀色、莖桿紅色，推測(cè)ArCCS基因和AfCCS基因的組織差異表達(dá)可能是造成其表型顏色差異的因素之一；但是，福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮的根部顏色無(wú)明顯差異，主要是因?yàn)楦块L(zhǎng)期缺光，導(dǎo)致辣椒紅素?zé)o法合成。田士林[18]對(duì)辣椒CCS基因的研究表明，CCS基因受光誘導(dǎo)調(diào)控，既可在紅色辣椒中表達(dá)也可在淺黃色辣椒表達(dá)；但大棚栽培和套袋遮光均會(huì)降低CCS基因表達(dá)，進(jìn)而減少辣椒紅素積累，影響果實(shí)顏色[24]。

綜上，本研究成功克隆到福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮的CCS基因，發(fā)現(xiàn)二者序列及其編碼蛋白具有高度的相似性，但二者的表達(dá)特性存在顯著差異并受到環(huán)境因素的顯著誘導(dǎo)，為一進(jìn)步研究其功能提供借鑒。

圖4 ArCCS基因與AfCCS基因在根、莖、葉中的表達(dá)Figure 4 The expression of the ArCCS and AfCCS gene in the root，stem and leaf

圖5 ArCCS基因與AfCCS基因在鹽脅迫下的表達(dá)Figure 5 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the salt stress

圖6 ArCCS基因與AfCCS基因在紫外光誘導(dǎo)下的表達(dá)Figure 6 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the UV stress

圖7 ArCCS基因與AfCCS基因在紅光誘導(dǎo)下的表達(dá)Figure 7 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the red light stress