陳嘉茵，方 苓，吳詩微，唐書澤，張志強(qiáng)，李 暉,*，吳希陽,*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511430；3.香港中文大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品及營養(yǎng)學(xué)部，香港）

食源性病毒疾病是一個(gè)正在受到關(guān)注的問題。在世界范圍內(nèi)，有大于50%的急性腸胃炎事件是由諾如病毒所造成[1]。諾如病毒是單鏈RNA病毒，由3 個(gè)閱讀框架（OF1、OF2與OF3）組成，并根據(jù)其基因組可以分為GI～GV 5 種基因型，而GI、GII和GIV對人類有感染性，其中導(dǎo)致世界性諾如病毒疫情爆發(fā)的基因型為GII[2-6]。諾如病毒最早在1972年被Kapikan等[7]所檢出，它具有感染劑量低、能忍受大范圍溫度變化等特點(diǎn)[8-9]。它主要傳播途徑為“糞—口”傳播，可通過人與人之間直接傳播，或接觸到被污染的水和食物而進(jìn)行傳播[10]，常受到污染的食品有蔬菜、軟質(zhì)水果、貝類等[11-15]。

生菜作為飯桌上常見的生熟食均可的菜品，近年來人類為了追求健康，對蔬菜沙拉的需求增大，生吃生菜的人群逐漸增多，因受灌溉用水的潔凈度與廚工的安全衛(wèi)生意識水平影響，生食生菜使得人類的患病風(fēng)險(xiǎn)也在提高。2012年馬來西亞爆發(fā)了第一起感染源為生菜的諾如病毒疫情[16]。2010—2015年美國疾病預(yù)防與控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，因生菜原因造成的諾如病毒疫情達(dá)到93起，患病人數(shù)共2 028 人[17]。丹麥2016年也曾因輸入法國的染毒生菜導(dǎo)致1 個(gè)月內(nèi)就有23 起諾如病毒疫情爆發(fā)[18]。

目前諾如病毒的檢測方法有多種，主要分成3 部分：電鏡、免疫電鏡觀察法，免疫學(xué)檢測和核酸水平上的檢測方法。其中電鏡檢測結(jié)果受主觀因素影響較大（如電子顯微鏡質(zhì)量，操作者熟練程度等），同時(shí)靈敏度不高，不適用于爆發(fā)性疫情的大規(guī)模檢查[19]。酶聯(lián)免疫吸附測定主要針對諾如病毒的蛋白質(zhì)外殼進(jìn)行檢測，但因病毒蛋白的變異性強(qiáng)，導(dǎo)致該方法敏感性，特異性較弱[8]。核酸水平上諾如病毒的檢測方法主要有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法包括常規(guī)RT-PCR、多重RT-PCR、巢式PCR等及逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法，但RT-PCR法在電泳過程中容易出現(xiàn)交叉污染問題，造成假陽性結(jié)果[19]。多重RT-PCR盡管可以同時(shí)檢測多種目標(biāo)分子，減少反應(yīng)時(shí)間，但其靈敏度較低，實(shí)驗(yàn)條件較為苛刻，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，因此RT-PCR法大多作為定性分析及判別病毒基因型用[20]。目前RT-qPCR法是檢測諾如病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它具有特異性強(qiáng)，靈敏度較高的特點(diǎn)，可以對樣品中的病毒數(shù)量進(jìn)行較為精確的定量[21-24]。然而在RT-qPCR檢測中，若樣品存在PCR抑制物，則會降低其靈敏度和準(zhǔn)確性，易造成假陰性[23,25]。同時(shí)RT-qPCR法需要依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性才能對樣品進(jìn)行定量分析，存在一定的不確定性[26]，難以檢測微小的拷貝數(shù)變化，靈敏度有限也是qPCR的一個(gè)缺點(diǎn)[27]。鑒于諾如病毒是一種高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高對諾如病毒檢測的靈敏度，建立可信的檢測方法，科學(xué)評估受感染食品的安全風(fēng)險(xiǎn)是一個(gè)急需解決的問題。

微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一種與qPCR不同的定量技術(shù)，相比qPCR，它有著不一樣的優(yōu)點(diǎn)。ddPCR對檢測目標(biāo)的定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，它是通過在反應(yīng)前將體系與微滴產(chǎn)生油混合，由微滴生成儀生成上萬個(gè)液滴，每個(gè)液滴中不包含或包含一個(gè)或數(shù)個(gè)目的核酸，而每個(gè)液滴可看作一個(gè)PCR，在反應(yīng)完畢后讀取儀將讀取液滴的熒光強(qiáng)度與液滴數(shù)目，根據(jù)泊松分布從而進(jìn)行拷貝數(shù)定量的技術(shù)[28]。通過微滴的離散技術(shù)，它能減少樣品PCR抑制物對檢測的影響，從而提高了靈敏度和擴(kuò)增效率，檢測可達(dá)個(gè)位拷貝數(shù)，適合用于檢測低濃度或抑制物含量高的樣品[29-30]。

本實(shí)驗(yàn)建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測生菜中GII型諾如病毒（norovirus genegroup II，NoV GII）的RT-ddPCR方法，能檢測到低含量的病毒，為諾如病毒檢測提供了新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶油生菜（染毒用食品材料）購自廣州美思佰樂太陽新天地超市，并保存于4 ℃冰箱。

質(zhì)粒制備：Primescript One step RT-PCR kit ver.2（RR055A），TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（9762），TaKaRaMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 （9761）QuickCut? Kpn I（1618） 寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit（CT101-01） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒（DP103） 天根生化科技（北京）有限公司。

病毒洗脫：T r i s/甘氨酸/牛肉浸膏緩沖液（TGBE）：Trisbase 12 g、甘氨酸 3.8 g、牛肉膏 10 g、無RNase超純水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值到9.5；4×聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/NaCl溶液：PEG 8000 400 g、NaCl 69.6 g、無RNase超純水定容至 1 000 mL；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：Na2HPO4·12H2O 1.15 g、 KH2PO40.2 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g、無RNase超純水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.3。以上溶液均經(jīng)高壓滅菌。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

病毒核酸提?。篞IAamp viral RNA mini kit（52904）德國QIAGEN公司；RT-qPCR：One step primescript RT-PCR kit （Perfect Real Time）（RR086A） 寶生物工程（大連）有限公司；RT-ddPCR：One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes（186-4021）、RT-ddPCR Droplet Generation Oil（1863005）、RT-ddPCR Droplet Reader Oil （1863004）、Droplet Generator DG8 Cartndge （1864008）、Droplet Gene rator DG8 Gasket（1863009）、Droplet Generator Cartridge Holder（1863051）、Pierceable Foil Heat Seal（1814040）美國Bio-Rad公司；Twin.tec PCRPlate 96 德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200 Droplet Digital PCR System、PX1? PCR Plate Sealer、CFX96熒光定量PCR儀、C1000梯度PCR儀 美國Bio-Rad公司；X3FR超微量分光光度計(jì)、ST16R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；SK-O180-Pro搖床美國Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 陽性參照樣品的制備

經(jīng)測序確定為NoV GII的糞便標(biāo)本，加入pH 7.0的PBS制成10%的便懸液，混勻，再用PBS依次稀釋至10－3并命名為高、中、低濃度（高濃度糞便樣本核酸經(jīng)RT-ddPCR測定值為1.70×104copies/μL，中濃度測定值為1 725 copies/μL，低濃度測定值為160 copies/μL），用于后續(xù)的食品染毒，每濃度留200 μL用于提取RNA。其中糞便標(biāo)本及用于特異性檢測的常見腸道病毒核酸（GI型諾如病毒、札如病毒、輪狀病毒、星型病毒、腺病毒）均由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所提供。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

按照Loisy中NoV GII的上游引物和探針序列及Kageyama中的NoV GII下游引物合成引物探針[31-32]，該引物探針是根據(jù)GenBank上登錄的Lordsdale病毒（登錄號x86557）中的5 012～5 100的位置設(shè)計(jì)，上游引物QNIF2：5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’；下游引物COG2R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’；探針QNIFs：5’-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-3’，探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告集團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1，上述引物和探針均由上海閃晶公司合成及標(biāo)記。

1.3.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用熒光定量PCR檢測的引物對提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件為50 ℃、30 min（逆轉(zhuǎn)錄），94 ℃、2 min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶及激活聚合酶），94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次，72 ℃、10 min（滅活酶）結(jié)束，目標(biāo)長度為89 bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳，切膠回收后按照質(zhì)粒制備試劑盒說明書進(jìn)行操作。將制備成功的質(zhì)粒再用質(zhì)粒提取試劑盒提取，后用qPCR進(jìn)行分析鑒定；將篩選的陽性重組質(zhì)粒測序。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，序列正確的陽性質(zhì)粒即為NoV GII的標(biāo)準(zhǔn)品。陽性標(biāo)準(zhǔn)品用限制性內(nèi)切酶Kpn I進(jìn)行酶切，體系為：10 μL標(biāo)準(zhǔn)品，1 μL Kpn I酶，5 μL 10×QuickCut Buffer，用無RNase超純水補(bǔ)至50 μL，37 ℃孵育6 h。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，確認(rèn)全部酶切完成后，用DNA產(chǎn)物回收試劑盒回收線性質(zhì)粒，并用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量讀數(shù)，計(jì)算出拷貝數(shù)后進(jìn)行10 倍連續(xù)梯度稀釋，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品處理

食品染毒：將生菜每份25 g分裝，每份生菜中加入100 μL NoV GII陽性糞便染毒液，點(diǎn)狀涂布于菜葉表面約20 個(gè)點(diǎn)，并放于4 ℃干燥過夜以增加附著量，每個(gè)濃度做3 個(gè)重復(fù)，同時(shí)準(zhǔn)備未染毒生菜樣品作為陰性對照。

病毒洗脫步驟（參考ISO/TS 15216-1∶2013[31]）：將生菜切成約2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的小塊，裝入250 mL錐形瓶中，加入40 mL TGBE緩沖液，用錫紙蓋好瓶口。室溫250 r/min振蕩20 min。振蕩液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃、10 000 r/min離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH 7.0。加入1/3體積的4×PEG 8000/NaCl溶液，使終質(zhì)量濃度達(dá)到100 g/L PEG 8000，0.3 mol/L NaCl。60 s搖勻，在4 ℃、100 r/min孵育60 min后4 ℃、10 000 r/min離心30 min。棄上清液，再4 ℃、10 000 r/min離心5 min，緊實(shí)沉淀并棄上清液。加入1 000 μL PBS進(jìn)行沉淀重懸。將重懸后的懸浮液均分為2 份，其中一份加入等體積的氯仿-正丁醇溶液（1∶1，V/V），渦旋混合，室溫孵育5 min，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相到新離心管中。將未經(jīng)氯仿-丁醇處理的懸浮液和處理后的富集液放于－20 ℃保存準(zhǔn)備提取RNA。

1.3.5 病毒RNA 的提取

按QIAamp viral RNA mini kit提取方法操作說明書提取RNA，置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 RT-ddPCR體系優(yōu)化

RT-ddPCR體系（20 μL）：采用One-step RT-RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑推薦的20 μL體系，以同一樣品的RNA核酸，分別對引物濃度（0.2～1.0 μmol/L）、探針濃度（0.05～0.5 μmol/L）、退火溫度（50～60 ℃）進(jìn)行研究。根據(jù)信號讀取結(jié)果判斷最優(yōu)體系。

1.3.7 敏感性實(shí)驗(yàn)

通過10 倍梯度稀釋的NoV GII線性陽性質(zhì)粒確定RT-ddPCR的檢測范圍。將連續(xù)梯度倍比稀釋好的陽性質(zhì)粒按照優(yōu)化后的RT-ddPCR條件進(jìn)行反應(yīng)。使用SPSS 22.0（IBM軟件公司）對RT-ddPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.8 特異性實(shí)驗(yàn)

用該對引物和建立的RT-ddPCR方法對NoV GII、GI型諾如病毒、札如病毒、星狀病毒、輪狀病毒、腺病毒進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為確定該反應(yīng)體系的重復(fù)性，對樣品進(jìn)行組內(nèi)（n=5）以及組間（n=3）實(shí)驗(yàn)。在3 周內(nèi)進(jìn)行檢測，每周檢測一次，計(jì)算組內(nèi)與組間檢測結(jié)果的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），判斷該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.3.10 人工染毒樣品病毒回收率計(jì)算

利用本實(shí)驗(yàn)建立RT-ddPCR方法分別對從不同染毒濃度蔬菜樣品處理后懸浮液所提取的病毒RNA連同用于染毒的不同濃度糞便樣本（高、中、低3 個(gè)水平）提取的病毒RNA進(jìn)行檢測，同時(shí)將樣品通過RT-qPCR進(jìn)行檢測，通過公式計(jì)算病毒回收率判斷更適合用于食品中病毒含量檢測的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過SPSS 22.0軟件采用雙因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性方差分析，同時(shí)圖像處理利用QX200 Droplet Digital PCR System提供的Quantasoft軟件（Bio-Rad）進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

采用RT-qPCR的上下游引物進(jìn)行常規(guī)PCR，得到大約89 bp的目的片段。構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-ng2標(biāo)準(zhǔn)品核苷酸測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，顯示其插入的基因片段為NoV GII.17，說明成功構(gòu)建了陽性標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品酶切后，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測量濃度并換算得標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為8.47×109copies/μL。

2.2 RT-ddPCR條件的優(yōu)化

根據(jù)軟件在各濃度下檢測出的核酸拷貝數(shù)，最終選用終濃度為0.9 μmol/L的引物和0.35 μmol/L探針濃度，模板添加量為2 μL。最佳循環(huán)條件：逆轉(zhuǎn)錄42 ℃、60 min，95 ℃、10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95 ℃變性30 s，54 ℃退火及延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)，98 ℃、10 min（滅活酶），爬坡速率為1 ℃/s。

2.3 RT-ddPCR的特異性

本實(shí)驗(yàn)建立RT-ddPCR方法對NoV GII有典型擴(kuò)增曲線，對其他病毒均無擴(kuò)增，表明這對引物在這RT-ddPCR方法上特異性良好（圖1）。

圖1 RT-ddPCR NoV GII特異性實(shí)驗(yàn)Fig. 1 Specificity of RT-ddPCR for NoV GII

2.4 RT-ddPCR的敏感性實(shí)驗(yàn)

R T-d d P C R對低濃度的陽性質(zhì)粒p-n g 2有擴(kuò)增，最低檢測限為2.12 copies/μL，最高檢測限為8.47×104copies/μL，濃度過高時(shí)液滴全部為陽性（8.47×105、8.47×106copies/μL），說明超過檢測上限（圖2）。將連續(xù)梯度稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-ddPCR分析，RT-ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.997 3，擴(kuò)增效率為95.44%，表明RT-ddPCR具有良好的線性關(guān)系。

圖2 RT-ddPCR檢測NoV GII敏感性實(shí)驗(yàn)Fig. 2 Sensitivity of RT-ddPCR for NoV GII

2.5 RT-ddPCR的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表1 一步法微滴數(shù)字RT-PCR檢測NoV GII重復(fù)性分析Table 1 Repeatability analysis of one-step RT-ddPCR detection of NoV GII

如表1所示，3 周內(nèi)組內(nèi)CV均小于4%，組間CV結(jié)果為1.75%，說明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 RT-ddPCR和RT-qPCR回收率計(jì)算結(jié)果

將樣品中提取的病毒RNA及各濃度染毒用糞便稀釋液中提取的病毒 RNA通過RT-ddPCR和RT-qPCR進(jìn)行分析，計(jì)算病毒回收率，結(jié)果見表2。

表2 RT-qPCR與RT-ddPCR對不同染毒濃度和方法 回收率計(jì)算結(jié)果對比Table 2 Mean percentage recovery calculated for three inoculum levels of NoV GII detected by quantitative PCR and RT-ddPCR%

根據(jù)不同染毒濃度和處理辦法在兩種檢測儀器上得出的回收率數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件中采用雙因素方差分析法進(jìn)行Tukey差異顯著性方差分析，表2表明高、中濃度下，4 種檢測方法沒有顯著性差異。低濃度下，未經(jīng)氯仿處理的qPCR結(jié)果與另外3 種方法均存在顯著性差異（低濃度下方法1平均回收率僅1.43%，方法2平均回收率為9.71%，方法3平均回收率為11.80%，方法4平均回收率為12.53%，P＜0.05）。而各種濃度下，方法2、方法3、方法4之間沒有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有的RT-qPCR技術(shù)檢測NoV GII等食源性腸道病毒存在因樣品染毒濃度低，經(jīng)富集后仍難以檢測出的問題，反映出RT-qPCR靈敏度的局限性。同時(shí)也存在檢測過程中受抑制物影響而導(dǎo)致無法檢測的情況[25]。雖然RT-qPCR法具有步驟簡便節(jié)省時(shí)間等好處，但其自身因需要標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線去判定樣品中目標(biāo)基因的數(shù)量，容易因時(shí)間地點(diǎn)和抑制物的原因而導(dǎo)致結(jié)果的偏差[25]。本研究將檢測NoV GII的RT-qPCR引物探針運(yùn)用到RT-ddPCR上，其擴(kuò)增效率超過95%及良好的線性關(guān)系表明RT-ddPCR具有定量檢測實(shí)際樣品的潛力。它通過將反應(yīng)體系微滴化，再利用終點(diǎn)檢測的方法，盡量減少了抑制物對反應(yīng)體系的影響，能有效檢測低濃度的病毒量。本研究顯示RT-ddPCR最低檢測限為2.12 copies/μL，并且檢測方法顯示出了良好的重復(fù)性。

盡管病毒在蔬菜中不能繁殖，但如何從蔬菜樣品中有效富集和洗脫病毒，減少抑制物帶來的影響，提取出高純度的RNA，對后續(xù)的樣品檢測是不可或缺的。在ISO/TS 15216-1∶2013標(biāo)準(zhǔn)中，食品中諾如病毒RNA的提取方法里蔬菜不用像軟質(zhì)水果經(jīng)過氯仿-丁醇的去抑制物處理，猜測是因?yàn)橄啾容^軟質(zhì)水果等容易在處理過程中釋放糖分果膠等PCR抑制物，而蔬菜中釋放的該類抑制物較少[23]。為去除生菜中可能含有的PCR抑制物，本實(shí)驗(yàn)將懸浮沉淀后得到的懸浮液分為兩份并對其中一份進(jìn)行氯仿-丁醇處理以對比處理前后抑制物對RT-qPCR與RT-ddPCR的影響。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著病毒數(shù)量的減少，蔬菜中的葉酸、色素等抑制物百分比含量上升，利用氯仿-丁醇去除抑制物的步驟顯得愈發(fā)重要，對比RT-qPCR與RT-ddPCR的回收率結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，RT-ddPCR在存在抑制物的影響下，檢測結(jié)果與去除抑制物后的回收率相差不大，沒有顯著性差異，且較低濃度下檢測結(jié)果均值比去除抑制物后的RT-qPCR結(jié)果要高，說明RT-ddPCR能有效抵抗PCR抑制物對反應(yīng)的影響，能代替RT-qPCR進(jìn)行日常食品樣品的檢測，且可以省略使用氯仿-丁醇去抑制物的步驟，節(jié)省時(shí)間同時(shí)有利于環(huán)境保護(hù)。

本實(shí)驗(yàn)針對諾如病毒疫情爆發(fā)的元兇主要為NoV GII[2-6]，且蔬菜作為其病毒的有效載體的情況成功建立了一步法RT-ddPCR檢測蔬菜中NoV GII的方法。該方法特異性良好，避免了兩步法中可能出現(xiàn)的污染，節(jié)省了時(shí)間，同時(shí)測定了該方法的最低檢測限達(dá)到個(gè)位拷貝數(shù)，具有極高的靈敏度，為食品中諾如病毒量小難以檢測這一難題提供了可行的解決方法，更切實(shí)地保障了食品安全性。