劉鳴暢，侯艷梅，王 斌，楊艷歌，吳亞君,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.海普諾凱營養(yǎng)品有限公司，湖南 長沙 410005）

隨著食品多樣化發(fā)展，高端乳及其制品產業(yè)發(fā)展迅速，羊乳作為高端小眾乳品以其致敏性低、營養(yǎng)成分易于吸收等特點受消費者青睞，這大大促進了羊乳及其制品產業(yè)的發(fā)展，銷量也逐年增加[1-2]，銷售額從2012年的20萬 元增長至2016年的52億 元[3]。但是在經濟利益驅動下，一些不法商販將牛乳或牛乳蛋白添加到羊乳等高值乳品及其制品中牟取利益[4-6]。為規(guī)范產業(yè)發(fā)展，保護消費者權益，2015版《食品安全法》中明確規(guī)定，禁止生產經營“摻雜摻假”食品，從法律層面將食品安全提升到更重要的位置，表明了打擊食品造假摻假、保障老百姓食品安全的決心。在2016年6月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局加強對嬰幼兒配方粉等特殊食品的監(jiān)管力度，頒布了《嬰幼兒配方乳粉產品配方注冊管理辦法》，其中明確規(guī)定嬰幼兒配方乳粉原料為羊乳（粉）的，產品名稱可標注為嬰幼兒配方羊乳粉，并且應當在配料表中標明每100 g產品中羊乳（粉）所占比例，以及乳清蛋白粉來源。這一系列舉措，反映出2008年以來，監(jiān)管部門對乳品尤其嬰幼兒配方粉安全的重視，也增加了企業(yè)約束力，增強了消費者信心。

目前，已經報道了一系列乳源成分核酸[7-8]、蛋白[9]、理化[10-12]、免疫[13-14]等檢測方法。Banerjee等[15]通過對線粒體DNA的D-loop區(qū)核酸片段進行特異性擴增，可檢測到液態(tài)乳或乳酪中0.1%的牛源性成分；Chen Renkun等[16]采用高效液相色譜與電噴霧-質譜聯用技術，可以精準檢測到羊乳中含量不小于5%的牛乳成分；Chen Qi等[17]采用超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜法技術，通過對β-乳球蛋白特征肽段定量檢測，實現對羊乳及其制品中牛乳成分的精準定量檢測；Anguita等[18]針對牛乳β-酪蛋白制備單克隆抗體，制備酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒，可對鮮乳及乳酪中的牛源β-酪蛋白成分進行檢測。不同方法應用范圍不同，各有優(yōu)缺點，核酸檢測靈敏度高，可檢測出較低成分的摻假物，但是由于嬰幼兒配方乳粉生產工藝復雜，物料多樣，容易造成交叉污染，因其中輔料的添加產生假陽性信號。ELISA檢測簡單快速，可作為快速篩查手段，但是現有市場上的抗體種類以及ELISA檢測產品范圍有限，而且對抗體質量依賴性較高，不利于大范圍推廣。液相色譜-質譜聯用技術可實現精準定量檢測，適合作為確證方法，但液相色譜-質譜聯用首先要通過蛋白酶將乳蛋白進行酶切，而嬰幼兒配方粉經過復雜加工工藝，其原料生產、貯存以及乳粉生產工藝的差別可導致不同程度的美拉德反應[19]，這會造成酶切位點修飾，影響酶切效率，此外，液相色譜-質譜聯用技術采用靶標肽段檢測，對于未知物種來源或未知加工方式的樣品難以檢測。

雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DGE）作為研究蛋白質組的重要技術之一[20]，1975年由O’Farrell發(fā)明，并成功對大腸桿菌蛋白進行了分離[21]。2DGE技術把復雜蛋白混合物中的蛋白質在第一向等電聚焦電泳和第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）2 個維度上進行分離[22]，從而達到良好的分離效果，獲得更全面、更豐富的蛋白質信息，已經在醫(yī)學、動物學、植物學、微生物學等多個領域得到很好的應用[23-25]。2DGE技術可以直觀地展現不同種類、來源食品蛋白的差異[26]，本實驗室也采用2DGE技術實現燕窩真?zhèn)巫R別[27]，并制定出入境檢驗檢疫行業(yè)標準；建立蜂王漿蛋白質組檢測的2DGE方法[28]，評價蜂王漿新鮮度，豐富了蜂王漿新鮮度檢測指標。

本研究采用2DGE技術，對牛乳、羊乳及其制品進行分析，發(fā)現不同乳源乳品蛋白差異。同時通過對梯度配比的羊乳嬰幼兒配方粉與牛乳嬰幼兒配方粉以及市售樣品的檢測，驗證2DGE技術可以作為評價牛羊乳真?zhèn)蔚囊粋€重要手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方羊乳粉、羊乳清粉、牛乳清粉、巴氏殺菌羊乳 海普諾凱營養(yǎng)品有限公司；牛乳配方粉樣品、液態(tài)牛乳 市購。

預染蛋白分子質量標準、兩性電解質（Bio-Lyte 4/6 Ampholyte、Bio-Lyte 5/7 Ampholyte）、IPG預制膠條（7 cm，pH 4～7）、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）溶液（pH 8.8）、四甲基乙二胺、二硫蘇糖醇、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽 美國Bio-Rad公司；BCA蛋白定量試劑盒 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

Labsystems Multiskan Spectrum酶標儀 美國Thermo公司；5418R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Mini Protean 3 Cell垂直板電泳儀、PharosFX激光成像系統美國Bio-Rad公司；MS3渦旋儀 德國IKA公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取1.5 g嬰幼兒配方乳粉樣品置于15 mL離心管中，加10 mL去離子水，渦旋振蕩，至充分溶解。使用BCA蛋白定量試劑盒對鮮乳樣品和乳粉樣品溶液的總蛋白進行測定，將蛋白質量濃度調整為20 mg/mL，于4 ℃保存，備用。

1.3.2 等電聚焦電泳

將樣品從4 ℃取出，渦旋振蕩，吸取10 μL樣品和150 μL水化液（8 mol/L尿素、4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽、40 mmol/L Tris、100 mmol/L二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質）混勻，使用IPG膠條進行等電聚焦電泳。條件設定為50 V主動水化8 h；250 V線性30 min；500 V快速30 min；4 000 V線性3 h；4 000 V快速40 000 V·h。

1.3.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE參照《蛋白質技術手冊》[29]中相關內容進行。其中分離膠濃度為12%。電泳條件為10 mA恒流電泳。電泳完畢，凝膠用考馬斯亮藍染液（50%甲醇、10%醋酸、0.25%考馬斯亮藍R250）染色1 h，用脫色液（25%甲醇、10%醋酸）脫色至凝膠背景消失，用蒸餾水浸泡1 h，隨后用凝膠成像系統拍照。

1.3.4 凝膠掃描及分析

將脫色并經過蒸餾水浸泡的凝膠放入PharosFX激光成像系統，收集2DGE圖譜，使用PDQuest軟件進行圖譜定量比較分析。

2 結果與分析

2.1 方法重復性結果

圖1 液態(tài)乳樣品圖譜重復性結果Fig. 1 2DGE maps of liquid cow milk repeatability evaluation in 3 independent experiments

為確保所采用的方法在蛋白組分分析中有良好的重復性，對同一份液態(tài)乳樣品進行3 次獨立重復2DGE分析，如圖1所示，蛋白點的位置與數量均保持一致，表明方法的重復性良好。分別測定圖1中高豐度蛋白點P1和低豐度蛋白點P2對其絕對光密度（蛋白點光密度×蛋白點面積）和相對光密度（蛋白點光密度×蛋白點面積與圖譜總蛋白點的平均光密度×蛋白點面積的比值）的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果如表1所示，P1和P2蛋白點3 次相對光密度的RSD低于絕對光密度的RSD，說明2DGE蛋白點相對光密度重復性最優(yōu)。

表1 光密度重復性實驗結果Table 1 Repeatability of optical density values in replicate experiments

2.2 牛羊乳特征蛋白篩選結果

圖2 牛羊乳及其制品2DGE圖譜Fig. 2 2DGE maps of cow and goat milk and milk products

如圖2所示，通過與現有研究[29]比對，牛乳、羊乳中所含蛋白種類基本相同，但由于性質差異，在液態(tài)乳和嬰幼兒配方粉的圖譜中可以發(fā)現，酪蛋白中牛源αS1-酪蛋白（cow αS1-casein，C-αS1-CN）和羊源αS1-酪蛋白（goat αS1-casein，G-αS1-CN）等電點基本相同，但C-αS1-CN分子質量大于G-αS1-CN；牛源αS2-酪蛋白（cow αS2-casein，C-αS2-CN）和羊源αS2-酪蛋白（goat αS2-casein，G-αS2-CN）分子質量相同，但G-αS2-CN等電點更大；牛源β-酪蛋白（cow β-casein，C-β-CN）和羊源β-酪蛋白（goat β-casein，G-β-CN）的分子質量和等電點基本相同。乳清蛋白中，牛源β-乳球蛋白（cow β-lactoglobulin，C-β-LG）和羊源β-乳球蛋白（goat β-lactoglobulin，G-β-LG）分子質量相同，G-β-LG等電點大于C-β-LG；牛源α-乳白蛋白（cow α-lactalbumin，C-α-LA）和羊源α-乳白蛋白（goat α-lactalbumin，G-α-LA）的分子質量和等電點基本相同。但是，每種乳在加工過程中，蛋白變化較小，所以初步選定C-αS1-CN、牛源κ-酪蛋白（cow κ-casein，C-κ-CN）、G-αS2-CN和G-β-LG作為乳源特征蛋白，判別羊乳嬰幼兒配方粉中是否添加牛乳成分。

2.3 檢測靈敏度結果

為考察乳源標志蛋白點C-αS1-CN、C-κ-CN、G-αS2-CN和G-β-LG的最低檢測限及線性關系，將羊乳嬰幼兒配方粉與牛乳嬰幼兒配方粉進行梯度配比，使牛乳嬰幼兒配方粉質量分數分別為0%、5%、10%、20%、50%、80%、95%、100%，并進行2DGE實驗，結果如圖3所示，通過PDQuest軟件分析，確定蛋白點光密度，并繪制工作曲線，如圖4所示。

圖3 不同配比梯度的乳粉樣品2DGE圖譜Fig. 3 2DGE maps of different proportions of cow milk powder

圖4 不同配比梯度的乳粉樣品牛羊乳特征蛋白光密度Fig. 4 Optical density values of different proportions of characteristic protein components in cow milk and goat milk

結果表明，C-αS1-CN、C-κ-CN、G-αS2-CN和G-β-LG蛋白的檢測靈敏度均可達到5%，其中，C-αS1-CN蛋白線性關系良好，線性相關系數可達0.97，可作為牛乳成分指征蛋白；G-β-LG蛋白線性關系良好，線性相關系數可達0.98，可作為羊乳成分指征蛋白。C-κ-CN和G-αS2-CN蛋白特異性良好，但線性關系較差，可作為乳源判定的輔助指標。

2.4 市售樣品檢測結果

圖5 市售樣品2DGE圖譜Fig. 5 2DGE maps of commercialized samples

表2 市售樣品檢測結果Table 2 2DGE detections of commercialized milk samples

從市場上購買8 份樣品，包括1 個液態(tài)羊乳產品、2 個液態(tài)牛乳樣品，1 個羊乳嬰幼兒配方粉產品、1 個牛乳嬰幼兒配方粉產品，2 個酸羊乳產品和1 個酸牛乳產品采用2DGE方法進行檢測，結果如圖5、表2所示。可以看出，市售液態(tài)羊乳、羊乳嬰幼兒配方粉和酸羊乳1中，均存在羊乳特征蛋白G-β-LG，可判定為羊乳產品。市售液態(tài)牛乳、牛乳嬰幼兒配方粉和酸牛乳中，可檢測到牛乳特征蛋白C-αS1-CN和C-κ-CN，可判定為牛乳產品。而酸羊乳2中，未檢測到羊乳特征蛋白G-β-LG，而牛乳特征蛋白C-αS1-CN和C-κ-CN清晰可見，判斷其為牛乳偽造的羊乳產品。

3 討論與結論

蛋白質組分析技術越來越多地應用于食品檢測。雖然相比于質譜技術，2DGE技術對手工操作依賴較大，似乎容易出現結果不穩(wěn)定的情況[30]。但本實驗研究表明，通過購買、配制標準化試劑，嚴格遵守標準操作規(guī)程，可以達到良好的重復性。采用相對定量方法時，蛋白點相對光密度比較穩(wěn)定，說明相對定量法可用于模擬摻假樣品中摻假物的半定量檢測。但是由于不同乳制品及不同廠家加工工藝差異較大，對蛋白質可能造成不同程度的影響，此外，營養(yǎng)強化蛋白的添加也可能造成蛋白比例的變化[31]，所以本方法不適于用作乳制品摻假成分的定量檢測。通過與已開展的牛羊乳相關2DGE研究結果[32]對比，發(fā)現本實驗得到的牛、羊乳蛋白指紋圖譜和報道的圖譜基本相同。牛、羊乳蛋白指紋圖譜之間存在明顯差異，主要體現在αS1-酪蛋白分子質量不同，αS2-酪蛋白、κ-酪蛋白以及β-乳球蛋白等電點不同，為牛羊乳制品中的鑒定提供了很好的指標。2DGE利用等電點和分子質量二維的信息，對蛋白的判定比較準確，加上在檢測過程中，不存在類似聚合酶鏈式反應這種指數放大信號，或者類似ELISA依賴抗體質量的情況，因此不會發(fā)生交叉污染或假信號的情況，可以作為樣品鑒定的確證方法。相比于質譜技術，雖然前者通量更高，但2DGE具有直觀地在同一張圖譜上呈現樣品所有蛋白點的優(yōu)點還是其他技術無法比擬的，這種直觀性和完整性在不同樣品之間的比對，尤其是未知標志蛋白，或未知樣品來源的情況下，尤其具有優(yōu)勢。同時，2DGE與質譜，主要是基質輔助激光解吸電離-飛行質譜的良好銜接也為后續(xù)的蛋白精準鑒定提供條件。

雖然2DGE技術相比于質譜技術，在復雜樣品（摻雜）的鑒定上存在識別難度，不同物種或組織來源蛋白分辨率不夠高，但是對于乳品蛋白，蛋白種類相對較少，酪蛋白和清蛋白分區(qū)明顯，體現在圖譜上就是蛋白點數量較少，分布區(qū)域清晰，差異明顯，加上乳品樣品前處理簡單，無需復雜的酶解過程，不會造成處理過程中蛋白的損失，對指紋圖譜的模式影響小，因此適用于2DGE技術。通過構建2DGE標準圖庫，也可以減少檢測過程中對標準樣品的依賴，適合市售商品的常規(guī)檢測。

通過梯度配比實驗，即可判定乳品中質量分數不小于5%的牛乳蛋白成分，能夠滿足市售樣品摻偽監(jiān)管需求。其中C-αS1-CN和G-β-LG相對含量和乳粉的摻雜比例具有良好的線性關系，可以用于定量檢測。針對8 份市售樣品的檢測，發(fā)現1 份用牛乳冒充羊乳，整個判定過程清晰直觀，一方面說明本方法對實際產品和不同類型產品的適用性，另一方面也說明市場的確存在不同物種來源乳品的摻假。在后續(xù)的研究中，本課題組將擴大對市場樣品的篩查范圍，同時探索定量檢測方法，更精確地判定商品標識的真實性。

2DGE圖譜信息豐度高、結果穩(wěn)定直觀，通過對圖譜中牛乳特征蛋白點的識別，即可判定乳品中質量分數不小于5%的牛乳蛋白成分，可以作為評價羊乳真?zhèn)蔚拇_證方法。