禹金龍，董 晨，王嫻靜，姬賽賽，付文靜，胡 潔，江 蕓,*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇 南京 210009）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是埃希氏菌屬的成員，屬于革蘭氏陰性菌兼性厭氧桿菌，從嬰幼兒出生幾個小時，便通過吞咽寄居在體內，與人類生活息息相關，一般情況下不會引起致病，是正常的腸道菌群[1]。但在機體抵抗力下降等情況下，大腸桿菌則通過腸道外途徑進入其他部位，造成相應部位的感染，所以又稱之為條件致病菌[2]。自從1885年發(fā)現以來，大腸桿菌在很長一段時間內一直被認為是人與動物胃腸道中的正常菌群，并無致病性，直到20世紀中期，有學者發(fā)現有些特殊的血清型對人、動物產生疾病[3-5]，根據它們所引起的疾病類型，致病性大腸桿菌可以分為兩大類：腹瀉性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌。腹瀉性大腸桿菌又可分為腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌、擴散附著大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌/產志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing E. coli，STEC）[6]。

在致病性大腸桿菌中，大腸埃希氏菌O157:H7感染劑量低、致病力強、危險性大、臨床癥狀嚴重，其污染和危害已成為全球性廣泛關注的公共衛(wèi)生問題[7-8]。然而，由于長期以來缺乏相應有效的檢測方法，人們更多關注O157，而非O157（non-O157）的危害性被低估甚至忽視。近年來國際上已越來越重視非O157的安全性，一些非O157對公眾健康的威脅甚至高于O157，美國于2001年開始對non-O157 STEC施行主動監(jiān)測[9]。據報道，美國1983—2002年發(fā)生的非O157的STEC感染者中，70%是由O26、O45、O103、O121、O111和O145血清型所致[10]，美國疾病預防控制中心已經將這6 種血清型命名為“big six”non-O157 STEC[11]。2012年3月，美國農業(yè)部USDA宣布強制執(zhí)行在初加工的牛肉制品中不得檢出這6 大類“big six”非O157 STEC[12]。目前我國對非O157尚未引起廣泛重視[13-16]，對非O157的研究亦少見報道。

本實驗參考美國農業(yè)部[17]及Svoboda等[18]的方法，調查牛糞和牛肉樣本中非O157大腸桿菌的污染情況，并對大腸桿菌O157及非O157（O26、O103、O111、O121）進行分離鑒定，對陽性菌株進一步進行毒力基因（stx1、stx2、eae、hly）檢測。目前國內鮮有關于非O157大腸桿菌污染情況的報道，本實驗將為非O157大腸桿菌的食品安全和風險評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

153 份牛糞樣品采自安徽省旌德縣兩家生態(tài)養(yǎng)牛場，49 份牛肉采自南京小型農貿市場，一共202 份樣品。

本實驗所用陽性對照菌大腸桿菌O157:H7一株（編號CICC 21530），非O157（O26、O103、O111、O121）DNA全基因組由江蘇省疾病預防控制中心提供。

緩沖蛋白胨水、改良胰蛋白胨大豆肉湯（modified tryptic soy broth，mTSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母浸粉（yeast extract，YE）、半固體動力培養(yǎng)基、亞碲酸鉀、頭孢克肟、P-10A新生霉素、P-10B新生霉素 北京陸橋技術有限公司；TaqTM（with Mg2＋free buffer）、100 bp DNA Marker、H抗原所用酶 大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；瓊脂糖 北京天根生化科技有限公司；multiplex PCR kit 德國Qiagen公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、4S Red染料 上海生工生物科技有限公司；rainbow agar培養(yǎng)基 美國Biolog公司；O26抗原、H11抗原等血清 日本生研公司。所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Mastercycler personal聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；GelDoc 2000 system凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TCL-16G高速離心機 上海安亭儀器廠；DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳儀 上海天能科技有限公司；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司；生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；拍打式均質器 青島眾瑞智能儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培養(yǎng)

參考美國農業(yè)部[17]及Svoboda等[18]的方法，稍作調整，進行增菌培養(yǎng)：牛糞樣品10 g、牛肉樣25 g以料液比1∶9（g/mL）添加緩沖蛋白胨水于均質袋中，均質2～3 min，取10 mL均質液加入到含有40 mL mTSB的均質袋中，于42 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)22 h。

1.3.2 增菌液DNA提取及多重PCR檢測O血清型

取1 mL樣品增菌液，按照說明書提取細菌DNA。采用多重PCR進行O抗原的鑒定[19]。PCR體系為25 μL，包括1 μL模板，PCR Master Mix 12.5 μL，O抗原引物（10 μmol/L）mix 2.62 μL，不足部分用水補齊。PCR條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增后的PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像觀察結果。O血清型陽性樣品進行進一步菌株分離純化。

1.3.3 菌株分離純化

上述O血清型陽性樣品的增菌液，取一環(huán)劃線于mRBA（添加0.05 mg/L頭孢克肟，0.15 mg/L亞碲酸鉀，5.0 mg/L新生霉素）培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，按照mRBA說明書及美國農業(yè)部指導說明，挑取特征顏色菌落，在mRBA培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線，經3 次分離純化，挑取單菌落劃線于非選擇性培養(yǎng)基TSA-YE上保存。

1.3.4 細菌基因組DNA提取及血清型鑒定

將可疑菌株挑1 環(huán)于150 μL滅菌雙蒸水中，渦旋，充分混勻。99 ℃水浴處理10 min，冰浴2 min，12 000×g離心2 min，吸取上清液即為細菌基因組DNA，－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

菌株O血清型的鑒定采用多重P C R進行，方法同上，對PCR陽性的菌株進一步采用血清凝集實驗進行驗證。鞭毛抗原分型采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法[20]。擴增fliC基因所用的引物為：5’-CAAGTCATTAATACAAACAGCC-3’和5’-GACATATTAGAGACTTCGGT-3’。擴增fliC基因并用HhaI酶切，根據酶切圖譜得出相應的鞭毛抗原類型。PCR體系為20 μL，包括0.3 μL模板，0.8 μL各引物（10 μmol/L），2 μL 10×Buffer（Mg2＋free)，2 μL Mg2＋，2 μL dNTP，0.2 μLTaq酶，不足部分用水補齊。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增后取PCR產物5 μL，加入HhaI酶及緩沖液，37 ℃酶切10 min后，取酶切液，在2%瓊脂糖凝膠中，85 V電泳50 min。比對酶切產物圖譜對照表確定H抗原類型。同時在半固體培養(yǎng)基中多次誘導，用血清凝集實驗進行驗證。

1.3.5 多重PCR進行毒力基因檢測

O血清型陽性的菌株采用多重PCR進行stx1、stx2、eae、hly4 種毒力基因攜帶情況檢測[21-22]。PCR體系為50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl25 μL，4 對引物（10 μmol/L）mix 9.4 μL，Taq酶0.25 μL，DNA模板1 μL，不足部分用水補齊。PCR程序：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃退火40 s，25 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR引物序列及擴增長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增長度Table 1 PCR primer sequences and amplification length

2 結果與分析

2.1 樣品O血清型檢測結果

如表2和圖1所示，202 份樣品多重PCR檢出一條或多條陽性條帶的樣品共40 份（19.8%），牛糞陽性檢出率為24.8%（38/153），牛肉陽性檢出率為4.1%（2/49），牛糞檢出率高于牛肉。其中非O157檢出率為19.3%（牛糞37＋牛肉2，39/202），O157的檢出率為0.5%（牛糞1＋牛肉0，1/202）。153 份牛糞樣本中，總陽性樣本38 份，O26有32 份，占20.9%，O121有7 份，占4.6%，O103有5 份，占3.2%，O157僅有1 份，占0.6%，49 份牛肉樣品中僅發(fā)現2 份O26樣本陽性，占4.1%，結果表明牛糞和牛肉中非O157大腸桿菌的陽性率均高于O157。

表2 牛肉及牛糞樣本中大腸桿菌O血清型檢出情況Table 2 Prevalence of E. coli O-groups in beef and fecal samples

圖1 部分牛糞樣本增菌液O血清型多重PCR電泳圖Fig. 1 Electrophoresis profile of multiplex PCR-amplified products for O-groups of some fecal enrichment broths

2.2 菌株O血清型檢測結果

圖2 部分菌株O血清型多重PCR電泳圖Fig. 2 Electrophoresis profile of multiplex PCR-amplified products for O-groups of some isolates

陽性樣本增菌液用mRBA選擇性培養(yǎng)基3 次劃線純化后，煮沸法提取DNA后采用多重PCR和血清凝集實驗共鑒定出陽性菌株30 株，包括5 種O血清型，其中O26占73.3%（22/30），O121占16.7%（5/30），O103占6.7%（2/30），O157占3.3%（1/30），O111未檢出，部分菌株O血清型多重PCR見圖2。結果顯示O26是優(yōu)勢血清型。

2.3 菌株鞭毛抗原分型

經圖譜對照及血清凝集實驗驗證，在O26中，O26:H11是主要污染菌株，占59.1%（13/22），其次是O26:H-，占22.7%（5/22），O26:H14與O26:H19均占9.1%（2/22）。2 株O103鞭毛抗原均為H2。5 株O121中，3 株為O121:H19，另2 株則為O121:H-。1 株O157為O157:NM。

2.4 毒力基因檢測結果

如圖3所示，分離自牛肉的2株O26:H11，1 株stx1、hly陽性（泳道3），另1 株hly陽性（泳道4），而牛糞分離菌中，僅發(fā)現1 株O26:H11菌株呈現hly陽性（泳道6）。因此，30 株菌株中帶毒菌株陽性率為10.0%（3/30），非O157 STEC陽性率為3.4%（1/29）。

1. 1 000 bp ladder Marker；2.大腸桿菌O157:H7（CICC 21530）；3.牛肉分離菌1；4.牛肉分離菌2；5.牛糞分離菌1；6.牛糞分離菌2；7.陰性對照菌DH5α；8. PCR陰性對照。

3 討 論

近年來，關于非O157 STEC，尤其是“big six”STEC爆發(fā)流行的報道逐漸增多，國外尤其是發(fā)達國家對大腸桿菌“big six”的關注度越來越高，據美國疾病預防控制中心2010年報告，在非O157 STEC中，患病率依次為O26（22%）、O111（16%）、O103（12%）、O121（8%）、O45（7%）和O145（5%）[23]，與O157患病率大體一致，表明非O157 STEC對人類的健康威脅不容忽視。然而我國對非O157 STEC尚未引起足夠重視。

反芻類動物，如牛、羊，是非O157 STEC的主要宿主，在屠宰過程中，通過去皮或去內臟等污染肉類，牛糞中STEC是污染動物性食物的主要來源[24-25]。牛源性非O157 STEC的流行數據尚未完善，原因在于分離鑒定非O157 STEC方法尚未標準化，如何有效地從含有大量背景菌中的糞便中分離出目的菌株，對選擇性增菌液以及分離純化培養(yǎng)基有著較高的要求[26]，Zelyas等[27]對4 種顯色培養(yǎng)基分離非O157 STEC的效果進行了評價，表明mRBA培養(yǎng)基與CHROMagar?STEC培養(yǎng)基能有效分離非O157 STEC。本實驗參考美國農業(yè)部[17]及Svoboda等[18]方法，采用多重PCR方法，預先篩選非O157陽性樣本，再利用mRBA培養(yǎng)基分離篩選，挑取特征顏色菌落，并進一步鑒定。有研究報道從食品安全角度考慮，先采用多重PCR檢測毒力基因進行初篩，再對毒力基因陽性的樣本進行分離鑒定，而本實驗目的是了解我國非O157大腸桿菌的污染情況，故對毒力基因陰性的樣本也進行調查。

Elder等[28]研究發(fā)現牛糞中腸出血性大腸桿菌O157的污染與牛胴體污染情況存在顯著正相關，其他較多研究也表明糞便中非O157 STEC會導致牛肉受到一定污染[24-25]。因此本實驗牛糞中較高的檢出率，提示其相應牛肉及其制品存在著一定安全風險。然而糞便中致病菌污染牛肉由于屠宰加工過程中屠宰環(huán)境、屠宰工藝、衛(wèi)生管理等不同，其污染概率亦不相同，所以有必要加強其屠宰加工的衛(wèi)生管理，以有效控制其牛肉產品的安全。

非O157大腸桿菌的污染調查，國外已有較多報道，本實驗發(fā)現非O157的污染率明顯高于O157，這與Svoboda等[18]的報道相似。較多關于非O157 STEC污染情況有不同的報道，牛糞中非O157 STEC的檢出率為0.0%～16.9%[29-31]。牛肉中非O157 STEC污染調查也有不同報道，有的報道檢出率較高，達到15.5%～33.3%，如Koohmaraie[32]、Barlow[33]、Auvray[34]等的研究報道。然而還有一些非O157 STEC低檢出率的報道，如Jiang Yun等[35]調查美國小型牛肉加工廠非O157 STEC檢出率為3.5%，歐洲食品安全局[36]關于歐盟食品中檢出率為0%～5.9%。Hussein等[37]發(fā)現屠宰的牛非O157 STEC檢出率在2.1%～70.1%之間，環(huán)境因素、管理措施等可能會影響STEC污染率的變化。本實驗非O157 STEC檢出率為3.4%，但采樣地點和樣本量均有限，尚需加大調查規(guī)模和監(jiān)測力度才能更全面反映我國非O157大腸桿菌尤其是非O157 STEC的污染情況。

大腸桿菌O157和非O157感染劑量低、致病力強，雖然不耐熱，但肉在加工烹調過程中（如生熟未分開）、肉熟制后的包裝過程、熟肉制品的再次切配等均可能存在交叉污染，因此在實際生產、銷售及家庭加工過程中仍應該重視其安全防范。

4 結 論

牛糞和牛肉中非O157大腸桿菌的污染率明顯高于O157，尤其是O26:H11血清型最高，且檢出含志賀毒素基因的菌株，這提示零售牛肉市場存在非O157大腸桿菌污染的安全風險，應加大對小型農貿市場肉類食品監(jiān)管，改善生產銷售條件，預防大腸桿菌的污染。