張 旭，張 海，周碧君* ，王開功，文 明，程振濤，羅引幸，劉麗娟，丁尊俄，趙大杰

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽550025;2.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽550025;3.貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心，貴陽550081)

牛乳頭狀瘤(bovine papillomatosis，BP)是由牛乳頭狀病毒(bovine papillomavirus，BPV)引起牛體表或黏膜的腫瘤性疾病，可引起良性和惡性腫瘤［1－2］。良性腫瘤在一般情況下可自行消退，但當環(huán)境因素和遺傳因素協(xié)同作用時會導致惡性腫瘤，導致牛死亡［3－4］。在集約化飼養(yǎng)場牛乳頭狀瘤十分普遍，其發(fā)病率較高，到目前為止依舊沒有有效的的疫苗來預(yù)防牛乳頭狀瘤病的發(fā)生［5］，在一定程度上造成了較大的經(jīng)濟損失。

BPV為無囊膜病毒，直徑為55～60 nm的正二十面體，其遺傳物質(zhì)的長度約為7000～8000 bp雙鏈閉環(huán)DNA分子［6］。BPV基因組含有3個區(qū)域:早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(L區(qū))和非編碼區(qū)(NCR)［7］，L區(qū)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。BPV L1基因編碼的衣殼蛋白暴露在病毒粒子表面，可能與病毒感染及免疫有關(guān)［8］;研究表明BPV L1蛋白具有B細胞特異性抗原表位，可誘導機體產(chǎn)生中和性抗體，激發(fā)保護性免疫，是進行預(yù)防免疫的主要抗原［9－10］。因此，BPV L1 蛋白是研制預(yù)防性疫苗的候選基因，也是臨床上診斷BPV理想抗原［11］，對牛乳頭狀瘤的診斷方法的建立具有重要價值。本試驗通過對BPV1貴州株(BPV1－GZLZ株)L1基因進行克隆、測序分析、構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold－BPV1－L1，并進行IPTG誘導表達L1重組蛋白，經(jīng) SDS－PAGE和 Western blotting分析，為BPV1診斷試劑和基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 牛乳頭狀瘤病毒1型貴州株(BPV1－GZLZ株)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞、pColdⅠ原核表達載體均由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存;Eco RⅠ、XhoⅠ、異丙基硫基半乳糖苷購自寶生物工程(大連)有限公司;兔源BPV1 L1多克隆抗體由貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心制備;2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA 提取試劑盒、His單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司;Tween－20、PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司，其他均為分析純化。

1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank公布的BPV1 L1基因序列，設(shè)計特異性引物，上游引物P1:5＇－CCGCTCGAGATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTG－3＇;下游引物 P2:5＇－CGGAATTCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGG－3＇;預(yù)期擴增片段長1488 bp，引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3 目的片段擴增及純化 采用DNA提取試劑盒對病料組織總DNA進行提取，以此為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50μL:上、下游引物(10μmol/L)各2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水19μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，35個循環(huán);72℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 BPV1－GZLZ株L1基因克隆及序列分析 回收純化目的DNA并連接至pMD19－T載體上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，利用含氨芐青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板篩選陽性重組子。提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定。將產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pMD19－T－L1，送往賽默飛世爾科技(中國)有限公司測序。利用DNAStar、Mega 5.0等軟件對BPV1－GZLZ株與國內(nèi)外主要的BPV參考毒株(表1)的核苷酸及其推導的氨基酸序列進行比對分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

表1 GenBank中登陸的BPV參考株序列信息Tab 1 GenBank landing BPV reference strains in sequence

1.5 BPV1－GZLZ株L1基因生物信息學分析 采用在線軟件 ExPASy(http://web.expasy.org/cgi－bin/protparam/protparam)分析預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。采用SPOMA在線服務(wù)器(https://npsa－prabi.ibcp.fr/cgi－bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);采用DNAStar軟件Protean程序預(yù)測B細胞表位多參數(shù);采用NCBI服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.Blast)預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域;采用 TMHMM2.0 Server在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0/)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域;采用 SignalP4.1 在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽。利用 SWISSMODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)在線預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.6 原核表達載體構(gòu)建

1.6.1 酶切與連接 用Eco RⅠ和 XhoⅠ對構(gòu)建的質(zhì)粒pMD19－T－L1和原核表達載體pColdⅠ進行雙酶切，37℃水浴過夜，酶切體系為40μL:10×H Buffer 4 μL，Eco RⅠ、XhoⅠ各 2 μL，pColdⅠ/pMD19－T－L1 20μL、ddH2O 12μL。酶切后采用膠回收試劑盒進行純化回收，將目的片段與線性pColdⅠ16℃連接過夜，連接體系為 10μL:目的片段 4μL、線性pColdⅠ 4 μL、SolutionⅠ 5 μL。

1.6.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，利用含氨芐青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板篩選陽性重組子。提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定。將PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pColdⅠ－BPV1－L1，送往賽默飛世爾科技(中國)有限公司測序。

1.7 重組蛋白誘導表達與鑒定 首先對含有陽性重組質(zhì)粒的BL21表達宿主菌進行誘導，再進行溫度和誘導條件的優(yōu)化，按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≌0.6 左右，加入 IPTG(終濃度為 1.0 mmol/L)，同時設(shè)立無IPTG誘導對照組，37℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5 h。取誘導表達菌液，離心取沉淀，用PBS洗滌一次，用 PBS懸浮沉淀，吹勻置于冰上超聲破碎處理，12000 r/min 4℃離心10 min，分別收集上清和沉淀，并對上清、沉淀和無 IPTG誘導組用 5×SDS蛋白上樣緩沖液沸水浴4 min制樣，用12%SDSPAGE鑒定。之后對重組原核表達蛋白進行Western blotting鑒定，一抗為His－tag抗體(稀釋度為1 ∶1000)，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(稀釋度為1∶1000)，最后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)－H2O2避光顯色，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPV1－GZLZ株L1基因PCR擴增 以提取的BPV1－GZLZ株陽性組織病料DNA為模板，進行L1基因特異性PCR擴增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到大小為1488 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果見圖1。

2.2 測序結(jié)果 將鑒定的陽性重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果采用DNAStar軟件進行序列拼接，獲得BPV1－GZLZ株L1基因核苷酸序列。由圖2可知，L1基因核苷酸序列長為1488 bp，編碼495個氨基酸。

圖1 BPV1－GZLZ株L1基因PCR擴增電泳圖Fig 1 Amplification of L1 gene of BPV1－GZLZ by PCR

圖2 BPV1－GZLZ株L1基因測序結(jié)果Fig 2 Secquencing result of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.1 BPV1－GZLZ 株 L1 基因核苷酸同源性分析將克隆的BPV1－GZLZ L1基因序列與GenBank上公布的15株牛乳頭狀瘤病毒14個基因型的L1基因進行核苷酸比對分析。由圖3可知，BPV1－GZLZ L1基因序列與牛乳頭狀瘤病毒1型BPV1(登錄號:X02346)的核苷酸序列同源性為99.8%，與 NCBI收錄的另外兩株BPV2(登錄號:JQ79817)、BPV2－GZ01(登錄號:KX113620)的同源性分別為82.9%、82.8%，與NCBI收錄1株BPV13(登錄號:JQ79817)的同源性為83.9%。

圖3 BPV1－GZLZ株L1基因的核苷酸同源性分析Fig 3 Nucleotide homology analysis of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.2 BPV1－GZLZ 株 L1 基因編碼蛋白氨基酸同源性分析 采用DNAStar軟件分析出BPV1－GZLZ L1基因的氨基酸序列，并與GenBank中公布的15株牛乳頭狀瘤病毒14個基因型的L1基因編碼氨基酸序列作同源性分析。由圖4可知，BPV1－GZLZ L1基因氨基酸序列與牛乳頭狀瘤病毒1型BPV1(登錄號:X02346)的氨基酸序列同源性為99.8%;與NCBI收錄的另外兩株 BPV2(登錄號:JQ79817)、BPV2－GZ01(登錄號:KX113620)的同源性分別為 92.1%、91.3%，與 NCBI收錄 1株 BPV13(登錄號:JQ79817)的同源性為92.7%。

圖4 BPV1－GZLZ株L1基因編碼蛋白的氨基酸同源性分析Fig 4 Amino acid homology analysis of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.3 BPV1－GZLZ 株 L1 基因系統(tǒng)進化樹分析將BPV1－GZLZ株L1基因與國內(nèi)外發(fā)表的BPV不同毒株L1基因的核苷酸序列采用DNAStar軟件繪制遺傳進化樹。結(jié)果顯示，BPV1－GZLZ株與BPV1(登錄號:X02346)處在同一遺傳進化分支(圖5)。由圖5可知，BPV1－GZLZ株與 BPV13(登錄號:JQ79817)和 BPV2(登錄號:JQ79817)、BPV2－GZ01(登錄號:KX113620)的親緣關(guān)系較近。

圖5 BPV1－GZLZ株L1基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig 5 Phylogenetic tree of L1 gene BPV1－GZLZ on nucleotide sequence

2.3 BPV1－GZLZ株L1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析使用ExPASy(Compute PI/MW)、ProtParam在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。L1蛋白分子質(zhì)量為55.55122 ku，分子結(jié)構(gòu)式為C2484H3884N678O737S16，理論等電點(PI)為 8.68。其氨基酸組成中Leu最多，占到9.1%，不含Pyl(0)和Sec(U)。在該蛋白的氨基酸中，堿性氨基酸有3種(Arg、Lys、His)，共 68 個，占 11.7%;酸性氨基酸有2 種(Asp、Glu)，共 52 個，占 10.5%;親水性氨基酸有 6 種(Asp、Glu、His、Lys、Ser、Thr)，共 165 個，占33.33%;疏水性氨基酸 9 種(Ala、Ile、Pht、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr)，共 217 個，占 43.84%，推測 L1蛋白為堿性蛋白。L1蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細胞、酵母和埃希氏大腸桿菌中表達的半衰期分別大于30 h、20 h 和10 h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為 39.38，低于閾值40，屬于穩(wěn)定類蛋白。

2.4 BPV1－GZLZ株L1基因B細胞表位預(yù)測

2.4.1 L1基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用SOPMA在線服務(wù)器預(yù)測L1基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖6)。由圖6可知，BPV1－GZLZ株L1基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包括α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和β－折疊，所占比例分別為 21.01%、12.12%、38.59%和28.28%。在整個蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲、β－折疊和α－螺旋區(qū)域出現(xiàn)相對較多，而此序列中β－轉(zhuǎn)角所占比例相對較少。

2.4.2 L1基因編碼蛋白B細胞多參數(shù)分析 采用DNAStar程序包中的Protean軟件綜合分析預(yù)測L1基因編碼蛋白B細胞表位各參數(shù)。采用 Kyte－D00little法分析親水性，Karplus－Schulz法分析柔韌性Jameson－Wolf法分析抗原指數(shù)和Emini法分析氨基酸表面可及性進行分析，以高于閾值的氨基酸殘基作為候選參考區(qū)域(圖7)。由圖7可知，該蛋白在整個氨基酸區(qū)域中，都具有良好的親水性，柔韌性分布較均勻，抗原性和表面可及性較高。

2.5 BPV1－GZLZ株L1基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 采用NCBI服務(wù)器上的CDART工具分析L1基因氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域(圖8)，由圖8可知，沒有發(fā)現(xiàn)具有明顯特征的保守結(jié)構(gòu)域。

圖6 BPV1－GZLZ L1基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig 6 Secondary structure prediction of BPV1－GZLZ L1 protein

圖7 BPV1－GZLZ L1蛋白B細胞表位參數(shù)預(yù)測Fig 7 B cell epitope prediction for L1 protein of BPV1－GZLZ by the DNAStar method

圖8 BPV1－GZLZ L1基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig 8 Conserved domain analysis of L1 protein of BPV1－GZLZ

2.6 BPV1－GZLZ株L1基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用TMHMM2.0 Server在線服務(wù)器對L1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測和分析(圖9)。由圖9可知，BPV1－GZLZ L1基因編碼蛋白發(fā)現(xiàn)無跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.7 BPV1－GZLZ株L1基因編碼蛋白信號肽預(yù)測采用SignalP4.1在線服務(wù)器對BPV1－GZLZ株L1蛋白序列中是否存在潛在的信號肽進行預(yù)測。結(jié)果顯示，此蛋白無信號肽，即為非分泌蛋白(圖10)。

圖9 L1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig 9 Prediction of trans membrane domains of L1 protein

圖10 L1蛋白信號肽預(yù)測Fig 10 The signal peptide analysis of L1 protein

2.8 原核表達載體構(gòu)建 將克隆的質(zhì)粒pMD19－TBPV1－L1與原核表達載體pCold I同時用Eco RⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，均能擴增出相應(yīng)的目的條帶(圖11)，將回收的目的片段進行純化回收，構(gòu)建原核表達載體pColdI－BPV1－L1，將構(gòu)建的質(zhì)粒進行菌液PCR鑒定(圖12)，送公司測序。

圖11 質(zhì)粒pMD19－T－BPV1－L1雙酶切Fig 11 Plasmid pMD19－T－BPV1－L1 double digestion

圖12 原核表達載體pCold I雙酶切Fig 12 Prokaryotic expression vector pCold I double digestion

2.9 pColdI－BPV1－L1原核表達及鑒定結(jié)果 對含有陽性重組質(zhì)粒 pColdI－BPV1－L1的BL21表達宿主菌進行溫度和誘導表達，12%的SDS－PAGE電泳鑒定結(jié)果(圖13)顯示，重組表達蛋白主要以包涵體形式存在，重組蛋白分子量約為55.6 kD，與理論值一致。

圖13 重組 pCold I－BPV1－L1蛋白表達產(chǎn)物的鑒定Fig 13 Identification of recombinant p Cold I－BPV1－L1 protein expression product

2.10 pColdI－BPV1－L1 重組原核表達蛋白的鑒定結(jié)果 Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導的重組表達蛋白能與His單抗和已制備好的兔源BPV1 LI多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，條帶為55.6 kD左右，與SDS－PAGE結(jié)果一致，結(jié)果見圖14和圖15。

3 討論與結(jié)論

牛乳頭狀瘤病在1929年被首次報道，現(xiàn)在世界各地都廣泛流行并傳播［12］。在我國新疆、東北和海南地區(qū)近兩年也有該病的報道［13］。BPV會影響牛產(chǎn)奶量出現(xiàn)下降和皮革質(zhì)量、生長性能等，嚴重的會導致牛死亡［14］。貴州省為快速發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)，從外地引進優(yōu)質(zhì)牛種，牛交易過于頻繁，給BPV的感染帶來了巨大的潛在風險，也給該省持續(xù)健康發(fā)展的養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。

圖14 重組蛋白pColdI－BPV1－L1的Western blotting鑒定Fig 14 Western blotting identification of recombinant protein pColdI－BPV1－L1

圖15 重組蛋白r His－L1的Western blotting鑒定Fig 15 Identification of recombinant protein r His－L1 by Western blotting

本研究應(yīng)用PCR擴增、克隆測序、生物信息學分析，構(gòu)建了pCold I－BPV1－L1原核表達質(zhì)粒并且成功誘導表達。結(jié)果顯示BPV1－GZLZ株L1基因序列全長是1488 bp，編碼495個的氨基酸，分子結(jié)構(gòu)式為C2484H3884N678O737S16，二級結(jié)構(gòu)主要包括α－螺旋、無規(guī)則卷曲和β－折疊為主。彭昊等［15］研究結(jié)果顯示，BPV－GX－LA150909與 BPV1參考株無論是基因組還是 L1基因同源性非常高，而本研究中BPV1－GZLZ L1基因序列與牛乳頭狀瘤病毒1型參考株BPV1的核苷酸和氨基酸同源性均為為99.8%，BPV1－GZLZ株與BPV1參考株處在同一遺傳進化分支，說明 BPV1－GZLZ株與 BPV－GXLA150909株可能均來自相同的來源。本研究采用外源基因常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)，與酵母、昆蟲、細胞等原核表達系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)簡單、成本低、生長繁殖快、表達量高等優(yōu)點。實驗選用了具有良好表達效果的pColdⅠ原核載體，該載體為氨芐抗性，載體帶有His－tag標簽，為方便進行后續(xù)的蛋白純化實驗。SDS－PAGE和Western blotting檢測結(jié)果顯示，重組表達蛋白主要以包涵體的形式存在，且與His單抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)，與預(yù)期結(jié)果相同，證明 L1基因在大腸桿菌BL21中得到了有效的表達;該蛋白具有均勻的柔韌性和良好的親水性，其抗原性和表面可及性也較高，但能否刺激機體產(chǎn)生體液免疫、產(chǎn)生特異性抗體，還需進一步研究驗證。