陳匯鑫，陳吉軒，唐建華，* ，畢海林，張 超，肖裕章

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶402460;2.重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶402460)

隨著生產(chǎn)生活方式的不斷轉(zhuǎn)變，胃腸功能障礙性疾病發(fā)病率逐年升高，國(guó)內(nèi)外促胃腸動(dòng)力藥物的用量也隨之不斷加大［1］，目前常用促胃腸動(dòng)力藥物有多巴胺受體阻斷劑、5－HT4受體激動(dòng)劑、胃動(dòng)素受體激動(dòng)劑、阿片受體激動(dòng)劑以及中藥制劑等。莫沙必利作為一種高選擇性5－HT4受體激動(dòng)劑，在臨床中被廣泛使用，該藥物通過(guò)對(duì)腸肌層5－HT4受體的激活，加速神經(jīng)末梢對(duì)乙酰膽堿的釋放，并作用于胃腸道平滑肌，加快胃腸道蠕動(dòng)從而促進(jìn)胃腸道生理機(jī)能［2］，有研究表明，該藥物促胃腸動(dòng)力作用明顯優(yōu)于其他幾類促胃腸動(dòng)力藥物。

目前，越來(lái)越多藥物致意外流產(chǎn)事件的發(fā)生，使藥物的妊娠安全性受到廣泛關(guān)注，流產(chǎn)可分為自然流產(chǎn)及人為因素流產(chǎn)，其中染色體異常、母體內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染等均能造成自然流產(chǎn)，而人為因素流產(chǎn)多為藥物所致的流產(chǎn)作用，其中包括藥物對(duì)母體性激素水平的改變、對(duì)胚胎的毒性等。有研究表明，目前獸醫(yī)臨床中常用促胃腸動(dòng)力藥物氯化氨甲酰甲膽堿及甲硫酸新斯的明因其對(duì)子宮平滑肌的收縮作用，不能用于妊娠動(dòng)物［3］，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)按妊娠期孕婦用藥的安全性將藥品分為5大類，其中人醫(yī)臨床中常用促胃腸動(dòng)力藥物多為B類、C類以及未分級(jí)［4］，按其分級(jí)方法說(shuō)明［5］可知，多數(shù)促胃腸動(dòng)力藥物在妊娠期的使用安全性均有待進(jìn)一步考證，這對(duì)于臨床用藥而言是一個(gè)極大的隱患。據(jù)此本研究通過(guò)觀察小鼠妊娠過(guò)程中各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，建立一個(gè)完整的判斷小鼠準(zhǔn)確妊娠日期及流產(chǎn)數(shù)的方法，同時(shí)通過(guò)觀察莫沙必利對(duì)妊娠后期小鼠流產(chǎn)率的影響以及測(cè)定給藥后血清中縮宮素、孕酮、雌激素、前列腺素含量，來(lái)判斷莫沙必利的妊娠安全性，并對(duì)潛在致流產(chǎn)作用機(jī)制進(jìn)行探究，以此為莫沙必利的臨床應(yīng)用提供參考價(jià)值，也為今后研究其他藥物對(duì)妊娠后期胚胎的影響提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 枸櫞酸莫沙必利片:成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)180109;米非司酮片:華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)43170507;米索前列醇片:華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)431706062;縮宮素、孕酮、雌激素、前列腺素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒:南京森貝伽生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)201809。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠99只(5周齡，30～35 g，昆明純種，雌雄比 2 ∶1)，由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠進(jìn)行一周適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫22～26℃，自由光照，每天定時(shí)定量飼喂。于買回后第7天開(kāi)始合籠，采用連續(xù)合籠的方式按雌雄比2∶1進(jìn)行合籠。

1.2 試劑配制 枸櫞酸莫沙必利混懸液:精密稱定莫沙必利100 mg溶于100 mL水中，超聲10 min，用檸檬酸調(diào)pH至3.5～4.5，配制為相當(dāng)于10 mg/kg對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，當(dāng)天使用;米非司酮混懸液:取米非司酮片1片，溶于25 mL水中，超聲30 min，配制為相當(dāng)于10 mg/kg對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，當(dāng)天使用;米索前列醇混懸液:取米索前列醇片1片，溶于20 mL水中，超聲30 min，配制為相當(dāng)于0.01 mg/kg對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，當(dāng)天使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 妊娠日期判斷

1.3.1.1 母鼠檢查 合籠后，每天觀察母鼠陰部變化情況2次并記錄，將其陰部變化分為明顯陰栓、隱性陰栓及發(fā)情;每天定時(shí)稱量小鼠體重，并觀察小鼠腹部形態(tài)，若觀察到其腹部明顯腫脹，且每天體重增長(zhǎng)變化明顯，記已懷孕。

1.3.1.2 準(zhǔn)確妊娠日期判斷方法 觀察到小鼠成功懷孕后。再比對(duì)每天觀察的陰部變化情況，以此判斷小鼠準(zhǔn)確懷孕時(shí)間:以交配時(shí)間算，觀察到有明顯陰栓記妊娠0 d;若無(wú)明顯陰栓但觀察到有隱性陰栓記妊娠0 d;若無(wú)明顯陰栓，也無(wú)隱性陰栓，但觀察到有發(fā)情或連續(xù)發(fā)情，且后一天陰部恢復(fù)正常狀態(tài)，記發(fā)情最后一天為妊娠0 d;除此以外的妊娠小鼠不參與試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。將對(duì)比到的陰部變化情況記為陰部有效變化。

1.3.2 流產(chǎn)率試驗(yàn)

1.3.2.1 母鼠給藥 于妊娠13 d開(kāi)始灌胃給藥，一天2次，連給2 d。莫沙必利組按10 mg/kg給藥;陽(yáng)性對(duì)照組按米非司酮10 mg/kg及米索前列醇0.1 mg/kg合用分次給藥;蒸餾水空白對(duì)照組按10 mL/kg灌胃給藥。

1.3.2.2 流產(chǎn)判斷方法

1.3.2.2.1 處死及解剖 于給藥后第三天(妊娠15 d)斷頭處死懷孕小鼠，打開(kāi)腹腔，觀察子宮在體形態(tài);取下子宮，分離附著的筋膜，觀察離體子宮形態(tài);打開(kāi)子宮，分離胚胎，觀察胎兒，胎盤發(fā)育情況。

1.3.2.2.2 流產(chǎn)數(shù)判斷 解剖后通過(guò)子宮整體形態(tài)及觀察到的胚胎發(fā)育情況將妊娠小鼠子宮分為流產(chǎn)子宮(完全流產(chǎn)子宮、不完全流產(chǎn)子宮)以及正常妊娠子宮;打開(kāi)子宮體，通過(guò)胎兒及胎盤的發(fā)育情況判斷流產(chǎn)數(shù)，將萎縮的胎兒及其附屬胎盤記為1個(gè)流產(chǎn)胚胎;將無(wú)胎兒，但有未完全吸收胎盤記為1個(gè)流產(chǎn)胚胎;將胎兒及附屬胎盤均正常發(fā)育記為正常胚胎。

1.3.3 血清性激素含量測(cè)定試驗(yàn)

1.3.3.1 小鼠采血及解剖 于妊娠15 d灌胃給藥，給藥量同 1.3.2.1 項(xiàng)，給藥后 1 h 摘眼球取血，取血后打開(kāi)小鼠腹腔，取下整體子宮分離附著的筋膜并稱重，觀察胚胎個(gè)數(shù)，計(jì)算小鼠胚胎平均重量。

1.3.3.2 血樣處理 血液在4℃下靜置10～20 min，凝固后2000～3000 r/min離心20 min，取上清液－20℃保存待測(cè)，使用ELISA試劑盒測(cè)定血清中縮宮素、孕酮、雌激素、前列腺素含量，方法按說(shuō)明書(shū)上操作。

1.3.4 數(shù)據(jù)記錄 統(tǒng)計(jì)小鼠陰部變化情況數(shù)，計(jì)算有效率，陰部有效變化率(%)=陰部有效變化數(shù)/陰部變化總數(shù)×100%。統(tǒng)計(jì)每只妊娠母鼠子宮內(nèi)胚胎發(fā)育情況，計(jì)算各組小鼠流產(chǎn)率，流產(chǎn)率(%)=流產(chǎn)胚胎/(流產(chǎn)胚胎+正常胚胎)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)中數(shù)據(jù)均采用 SPSS公司開(kāi)發(fā)的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)的表示形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent－samples T test)或配對(duì)t檢驗(yàn)(paired－samples T test)，多組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05判定，以P＜0.05時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠小鼠造模

2.1.1 陰部形態(tài)觀察 正常陰部形態(tài):陰道口緊閉，無(wú)其他異物;明顯陰栓:陰道內(nèi)有明顯黃白色或白色阻塞物，觸感堅(jiān)硬，且12～24 h后消失;隱性陰栓:陰部外突，陰道口擴(kuò)張且自然狀態(tài)下不閉合，觸感堅(jiān)硬，用小鑷子掰開(kāi)陰道口，有時(shí)可見(jiàn)內(nèi)部有栓子堵塞;發(fā)情:外陰明顯紅腫，觸感柔軟，陰道口擴(kuò)張，陰道內(nèi)濕潤(rùn)，大量分泌物(圖1～圖5)。

圖1 正常母鼠外陰Fig 1 Normal female vulva

圖2 明顯陰栓外陰Fig 2 obvious vaginal plug vulva

圖3 隱性陰栓外陰Fig 3 hidden vulva plug vulva

圖4 發(fā)情小鼠紅腫外陰Fig 4 estrus mice redness vulva

圖5 發(fā)情小鼠陰道大量分泌物Fig 5 estrus vaginal secretions

2.1.2 母鼠形態(tài)觀察 正常小鼠腹部平整，腹部左右凸起不明顯，飼后也只見(jiàn)腹部腹側(cè)膨脹。而妊娠小鼠在妊娠10 d左右就可見(jiàn)其腹部左右凸起明顯(圖6～圖7)。

圖6 正常母鼠腹部形態(tài)Fig 6 Abdominal morphology of normal female rats

圖7 妊娠10天左右母鼠腹部形態(tài)Fig 7 Pregnant mice abdominal morphology 10 days pregnant

2.1.3 妊娠小鼠體重變化 妊娠小鼠平均體重隨妊娠天數(shù)的變化見(jiàn)圖8，其變化趨勢(shì)圖符合多項(xiàng)式方程 Y=0.1014·x2－0.82139·x+33.48011，圖像頂點(diǎn)為(4.05025，31.81669)，一階導(dǎo)數(shù)方程為 Y=0.2028·x－0.82139，由此可知，從第 4 天開(kāi)始妊娠小鼠平均體重隨妊娠天數(shù)的變化逐漸加快，且從第9天開(kāi)始，每天的體重增長(zhǎng)超過(guò)1 g。

2.2 小鼠受孕情況

2.2.1 合籠后小鼠受孕情況 合籠后檢測(cè)到母鼠懷孕情況見(jiàn)表1。66只母鼠合籠后30 d共檢測(cè)到60只懷孕小鼠，另外6只母鼠一直未孕，懷孕母鼠占試驗(yàn)?zāi)甘罂倲?shù)的90.91%。

2.2.2 檢測(cè)到小鼠懷孕的方式 母鼠陰部變化情況見(jiàn)表2、表3。通過(guò)明顯陰栓檢測(cè)到懷孕小鼠36只，其陰部有效變化率為62.07%;通過(guò)隱性陰栓檢測(cè)到懷孕小鼠11只，其陰部有效變化率為26.19%;通過(guò)發(fā)情檢測(cè)到懷孕小鼠9只，其陰部有效變化率為4.55%;無(wú)特征懷孕小鼠4只，占懷孕母鼠總數(shù)6.67%。有效數(shù)據(jù)共56個(gè)，占試驗(yàn)?zāi)甘罂倲?shù)的84.85%。

圖8 妊娠小鼠平均體重隨妊娠天數(shù)的變化Fig 8 Changes in the average body weight of pregnant mice with the number of days of pregnancy

表1 合籠后檢測(cè)到孕鼠情況Tab 1 The condition of pregnant mice was detected after closing

表2 小鼠陰部變化情況統(tǒng)計(jì)Tab 2 Statistics of mouse genital changes

2.3 流產(chǎn)數(shù)判斷

2.3.1 子宮體形態(tài)觀察 正常妊娠:子宮通體粉紅，形似葡萄串狀，內(nèi)部胎兒及附屬胎盤均正常發(fā)育;完全流產(chǎn):在體以及離體子宮內(nèi)明顯出血，且極度縮小;不完全流產(chǎn):子宮內(nèi)有個(gè)別胚胎明顯縮小且燈光下觀察該胚胎內(nèi)部渾濁(圖9～圖11)。

2.3.2 流產(chǎn)胚胎數(shù)判斷 正常胎盤:連接胚胎腹側(cè)和子宮內(nèi)壁，呈粉紅色，形似人體紅細(xì)胞的扁平形態(tài);正常胎兒:胚胎外形個(gè)體圓潤(rùn)，內(nèi)部無(wú)血樣渾濁，打開(kāi)被膜可見(jiàn)模糊輪廓狀完整胎兒;吸收胎盤:將子宮剪成小段，用手輕捏子宮段，觸及到米粒大小硬物，取出觀察通體為暗紅色小顆粒;吸收萎縮胎兒:胚胎個(gè)體明顯較正常發(fā)育相同天數(shù)胚胎小，且內(nèi)部有明顯血樣渾濁，打開(kāi)被膜無(wú)完整胎兒個(gè)體(圖12～圖16)。

圖9 正常子宮Fig 9 normal uterus

圖10 完全流產(chǎn)子宮Fig 10 Complete abortion of the uterus

圖11 不完全流產(chǎn)子宮Fig 11 Incomplete abortion of the uterus

圖13 正常胎盤Fig 13 normal placenta

圖14 正常胎兒及附屬胎盤Fig 14 Normal fetus and attached placenta

圖15 吸收萎縮胎兒Fig 15 Absorbing atrophic fetus

圖12 正常胚胎及胎盤Fig 12 Normal embryos and placenta

圖16 流產(chǎn)無(wú)胎兒萎縮胎盤Fig 16 abortion without fetal atrophy placenta

2.4 小鼠流產(chǎn)統(tǒng)計(jì) 給藥后小鼠流產(chǎn)情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。莫沙必利組與空白組流產(chǎn)子宮數(shù)相比P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)莫沙必利組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組流產(chǎn)率分別為 0.00%、100.00%、1.79%，說(shuō)明莫沙必利不會(huì)引起妊娠后期小鼠流產(chǎn)。

表4 莫沙必利對(duì)妊娠小鼠的影響Tab 4 Effect of mosapride on pregnant mice

2.5 莫沙必利對(duì)性激素的影響

2.5.1 小鼠胚胎重量 根據(jù)小鼠子宮總重量及胚胎個(gè)數(shù)，計(jì)算小鼠胚胎均重，結(jié)果見(jiàn)表5。各組間整體子宮重量，胚胎數(shù)及胚胎均重均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明各組胚胎的發(fā)育時(shí)間相近。

2.5.2 血清性激素含量 給藥后血清中性激素含量見(jiàn)表6，莫沙必利組小鼠血清中各項(xiàng)性激素含量與空白組比較差異均不顯著;與陽(yáng)性組相比，血清雌激素、孕酮、前列素含量顯著降低。同時(shí)三組中血清縮宮素含量差異均不顯著，表明在給藥短時(shí)間內(nèi)米非司酮、米索前列醇、莫沙必利均無(wú)引起垂體后葉分泌縮宮素的途徑。

表5 小鼠子宮及胚胎重量Tab 5 mouse uterus and embryo weight

表6 孕鼠血清性激素含量Tab 6 Serum sex hormone levels in pregnant rats

3 討論

小鼠妊娠模型被應(yīng)用于多個(gè)研究之中，而在建模過(guò)程中，準(zhǔn)確妊娠日期的判斷并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。多項(xiàng)研究資料顯示判斷小鼠妊娠的常用方法有兩種，一是陰道涂片，檢查陰道中是否有精子存在;其次是通過(guò)陰栓來(lái)判斷小鼠是否懷孕。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰道明顯陰栓的有效率為62.07%，這表明，雖然檢測(cè)到明顯陰栓后成功妊娠幾率較其余兩者陰部變化情況大，但檢測(cè)到明顯陰栓的母鼠并非一定妊娠成功，陰栓是由雄性小鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在陰道內(nèi)凝固而形成［6］，陰栓只能表明公鼠與母鼠有交配行為，但交配后母鼠并非一定受孕，同理，通過(guò)陰道涂片法來(lái)判斷小鼠妊娠也存在相同的問(wèn)題。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果中只有56只懷孕小鼠數(shù)據(jù)有效，占試驗(yàn)總母鼠量的84.85%，其中有4只母鼠至發(fā)現(xiàn)其懷孕均未觀察到其陰部有任何變化，這說(shuō)明在母鼠交配后并無(wú)陰栓形成，同時(shí)另外6只母鼠至試驗(yàn)結(jié)束均未有任何妊娠跡象。所以通過(guò)常規(guī)妊娠日期判斷方法進(jìn)行試驗(yàn)會(huì)造成統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的誤差，而本次試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的妊娠日期判斷能極大的降低數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)過(guò)程中存在的誤差，而且由于各組小鼠胚胎均重組間差異均不顯著，表明各胚胎的發(fā)育時(shí)間基本相同，且試驗(yàn)中所觀察到的妊娠15 d胚胎外形與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，說(shuō)明該方法所判斷的小鼠妊娠日期準(zhǔn)確度高。

目前國(guó)內(nèi)外多數(shù)促胃腸動(dòng)力藥物使用說(shuō)明都是對(duì)孕婦的安全性尚不明確，有研究表明，妊娠期間時(shí)常伴有胃腸道激素分泌異常等情況，造成孕婦的消化道功能紊亂［8］，而在用藥過(guò)程中，多數(shù)醫(yī)師的建議是“如有不適，暫停用藥”，這就導(dǎo)致孕婦用藥過(guò)程都是在未知風(fēng)險(xiǎn)的情況下進(jìn)行，而且國(guó)內(nèi)外目前也都未見(jiàn)有促胃腸動(dòng)力藥物對(duì)妊娠動(dòng)物或孕婦影響方面的完整試驗(yàn)性研究，這對(duì)臨床用藥而言是一個(gè)極大的隱患。試驗(yàn)結(jié)果顯示莫沙必利組妊娠小鼠所有胚胎均正常發(fā)育，與空白組差異不顯著，表明莫沙必利并不會(huì)引起妊娠后期小鼠流產(chǎn)。

懷孕期間，母體各項(xiàng)性激素水平保持在一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，有研究表明，縮宮素、雌激素、孕酮、前列腺素均與妊娠期間子宮平滑肌的收縮有關(guān)［9］，其中孕酮可降低子宮平滑肌的敏感性，從而促進(jìn)子宮平滑肌的靜止，雌激素、前列腺素以及縮宮素均能促進(jìn)子宮的收縮。目前人醫(yī)臨床中常用的流產(chǎn)藥物為米非司酮配伍米索前列醇，其中米非司酮通過(guò)與孕酮和糖皮質(zhì)激素的拮抗作用［10］，使蛻膜絨毛退化、變性、壞死，再配以前列腺素衍生物米索前列醇促子宮平滑肌收縮，軟化宮頸的作用，兩者合用可達(dá)到安全終止妊娠的目的［11］，有研究表明，其完全流產(chǎn)率可達(dá)90%以上［12］，試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，陽(yáng)性組血清孕酮含量明顯降低，前列腺素含量明顯升高，而且雌激素含量也明顯升高，三者協(xié)同作用促進(jìn)子宮平滑肌收縮，達(dá)到流產(chǎn)的結(jié)局，而莫沙必利對(duì)此三種激素的分泌均無(wú)影響，表明莫沙必利并不會(huì)引起妊娠期間子宮平滑肌的收縮，同時(shí)也不會(huì)打破妊娠期間性激素之間的平衡，從而不會(huì)引起由于性激素的改變所造成的流產(chǎn)。

綜上所述，莫沙必利作為一種副作用小的高效促胃腸動(dòng)力藥物，其妊娠安全性同樣較高，因此，當(dāng)妊娠動(dòng)物發(fā)生消化道功能障礙性疾病時(shí)，可使用該藥物進(jìn)行治療。同時(shí)，因其安全性較高、藥效好且體內(nèi)消除快的特點(diǎn)，若將該藥物研發(fā)成為獸用制劑，用于家畜家禽及寵物行業(yè)，這不僅能很好改善目前獸醫(yī)臨床中所存在的促胃腸動(dòng)力藥物使用不規(guī)范的問(wèn)題，而且對(duì)于獸藥行業(yè)而言，有著極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。