彭國瑞，彭小兵，李旭妮，董令贏，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

腐敗梭菌(Clostridium septium)可引起人和多種動物的惡性水腫、肌肉壞死、氣性壞疽和壞死性腸炎以及羊快疫等疾病，該菌可分泌α、β、γ和δ等多種外毒素，其中α毒素是主要的致病性毒力因子和免疫保護性抗原［1－3］。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)也是一種重要的人畜共患病源菌［4］，根據(jù)產(chǎn)生外毒素 α、β、ε、ι種類的不同分為 A、B、C、D、E 5個型，其中D型常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的腸毒血癥，致死性強，ε毒素是該型主要致死性毒力因子和保護性抗原［5－6］。由這兩種病原菌引發(fā)的疾病往往發(fā)病急，病程短，來不及治療動物即發(fā)生死亡，故免疫接種是預防這兩種病最為有效的途徑之一。目前，國內(nèi)用于預防羊快疫和腸毒血癥的疫苗有羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗、羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗和羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗，近年來隨著養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，該類疫苗的需求逐年增加，但疫苗的檢驗合格率和實際免疫效果卻并不十分理想［7］。諸多研究表明，通過基因工程大腸桿菌制備的有毒性或是無毒性的重組 α毒素［8－9］和 ε毒素［10－12］均具有很好的免疫原性。本實驗構(gòu)建了可以共表達腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的雙基因表達載體，探究了共表達產(chǎn)物的反應原性、毒性和相互作用等生物學特性，并將其制成基因工程滅活疫苗，評價了該疫苗的免疫效力，為羊快疫和腸毒血癥基因工程多聯(lián)疫苗的研制提供了試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腐敗梭菌C55－1株、D型氣莢膜梭菌C60－3株、腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素及其抗毒素羊血清均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存，自誘導培養(yǎng)基由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所配制。pETDuet－1 購自 EMD Biosciences，Inc;E.coli BL21(DE3)購自北京康為世紀生物有限公司。HRP標記兔抗羊IgG購自Sigma公司，酶標二抗顯色試劑盒購自Vector公司。PCR mix購自艾德萊生物公司、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、EcoRⅤ、XhoⅠ和 DNA分子量標準等購自寶生生物(大連)公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司。LB肉湯、TG培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基等由北京中海生物科技有限公司提供，氫氧化鋁膠佐劑由中牧實業(yè)有限公司蘭州生物藥廠提供，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純或試劑純。體重16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物公司，1.5～2.0 kg家兔購自北京隆安實驗動物中心。

1.2 共表達載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的基因序列設(shè)計2對引物(表1)，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

表1 擴增α毒素和ε毒素引物Tab 1 Primers amplifying C.septium α－toxin and C.perfringens ε－toxin genes

1.2.2 PCR 擴增 反應體系(25 μL):10×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各 0.5 μL，模板 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 18 μL。分別以腐敗梭菌 C55－1株和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60－3株基因組為模板PCR擴增。Gcsa反應條件:94℃10 min;94℃ 1 min，50℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。Gcpe反應條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 2 min，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.2.3 pETDuet－Gcsa－Gcpe 的構(gòu)建 EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切Gcsa PCR產(chǎn)物和pETDuet－1質(zhì)粒，膠回收后，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，涂布Amp+LB平板，挑取單菌落，PCR和雙酶切鑒定。EcoRⅤ、XhoⅠ雙酶切經(jīng)鑒定陽性的重組質(zhì)粒pETDuet－Gcsa和Gcpe PCR產(chǎn)物，膠回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli BL21(DE3)，涂布 Amp+LB平板，挑取單菌落，進行PCR和雙酶切鑒定，同時送上海生工生物公司測序。

1.3 自誘導共表達及產(chǎn)物的鑒定

1.3.1 SDS－PAGE 分析 鑒定合格的 E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)接種 Amp+自誘導培養(yǎng)基，28℃ 220 r/min震蕩誘導表達24 h收獲，SDSPAGE電泳和灰度掃描分析表達量。

1.3.2 Western－blot鑒定 以腐敗梭菌抗毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清分別作為一抗，HRP標記兔抗羊IgG作為二抗進行Western－blot檢測。

1.3.3 毒性和毒性中和試驗 自誘導收獲的E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)菌液經(jīng)超聲波裂解，0.2 mL/只腹腔注射小鼠5只，鑒定表達產(chǎn)物的毒性。將腐敗梭菌抗毒素血清和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清分別與裂解菌液1∶1(V/V)混合，37℃孵育40 min，0.4 mL/只腹腔注射小鼠各5只;將兩種抗毒素一同與裂解菌液1∶1∶1混合，37℃孵育40 min，0.6 mL/只腹腔注射小鼠5只，進行毒性中和試驗。同時設(shè)E.coli BL21(DE3)裂解菌液、2種抗毒素血清和自誘導培養(yǎng)基對照，觀察7 d。

1.4 共表達產(chǎn)物的免疫效力評價

1.4.1 滅活疫苗的制備 自誘導收獲的 E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)菌液，加 0.4%甲醛溶液，密封，37℃滅活3 d，每天輕搖4～5次。滅活完全后加20%滅菌氫氧化鋁膠混勻，作為滅活菌苗備用。

1.4.2 無菌檢驗與安全檢驗 疫苗按照《中國獸藥典》2015版三部規(guī)定的方法進行無菌檢驗［13］。家兔4只各皮下注射疫苗5.0 mL，觀察10 d，進行安全檢驗。

1.4.3 免疫效力評價 疫苗1.0 mL/只頸背部皮下注射免疫家兔10只，對照組10只注射20%鋁膠PBS，21 d后以同樣的方法進行二免。按照《中國獸藥典》相關(guān)疫苗規(guī)定的方法，測定免疫血清中和效價并用毒素攻擊，分別采集一免21 d后和二免14 d后血清，將同組同次采集的血清等量混合制成混合血清，與經(jīng)適當稀釋的腐敗梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別 1 ∶2 混合，37 ℃孵育40 min，0.3 mL/只尾靜脈注射小鼠各2只，觀察3 d，直到血清剛好能中和毒素。二免14 d后取免疫組家兔5只和對照組5只耳緣靜脈注射1 MLD腐敗梭菌毒素，另取免疫組5只和對照組5只注射1 MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，觀察7 d。

2 結(jié)果

2.1 共表達載體的鑒定 提取待鑒定菌落的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，用引物Fcsa和Rcsa PCR鑒定，見大小約1330 bp的片段與Gcsa預期大小接近;用 EcoR V、XhoⅠ雙酶切，引物 Fcpe和 Rcpe PCR鑒定，見大小約900 bp片段與Gcpe預期大小接近(圖1);測序結(jié)果顯示，Gcsa和Gcpe序列和閱讀框正確。以上結(jié)果表明，共表達載體pETDuet－Gcsa－Gcpe構(gòu)建成功。

圖1 共表達載體的鑒定Fig 1 Identification of the co－expression vector

2.2 SDS－PAGE 和 Western－blot鑒定 自誘導E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)表達產(chǎn)物經(jīng) SDSPAGE分析，以腐敗梭菌抗毒素血清和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清分別為一抗Western－blot檢測。結(jié)果顯示，在約49 ku處見特異條帶能夠與腐敗梭菌抗毒素血清反應條帶，表達量為0.28 mg/mL，在約33 ku處見可與產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清反應的條帶，表達量為0.39 mg/mL(圖 2)。結(jié)果表明，Gcsa和Gcpe實現(xiàn)了共表達，且均具有反應原性。

圖2 共表達產(chǎn)物的SDS－PAGE和Western－blot鑒定Fig 2 Identification of the co－expression by SDS－PAGE and Western blot

2.3 毒性和毒性中和試驗 小鼠注射了沒有中和和用單一抗毒素血清中和的裂解菌液后，在觀察期內(nèi)全部死亡;注射了用2種抗毒素中和的菌液以及E.coli BL21(DE3)菌液、抗毒素血清和自誘導培養(yǎng)基小鼠，均存活(表2)。結(jié)果表明，共表達產(chǎn)物同時具有2種毒素的毒性，進一步證實Gcsa和Gcpe獲得了共表達。

2.4 疫苗的無菌檢驗和安全檢驗 疫苗接種培養(yǎng)基均無菌生長，接種家兔后在觀察期內(nèi)全部健活。結(jié)果表明，所制備的疫苗無菌檢驗和安全檢驗合格，可以用于免疫效力評價。

表2 共表達產(chǎn)物的的毒性及其中和試驗Tab 2 Result of toxicity and neutralization test of co－expression

2.5 免疫效力評價 疫苗免疫家兔，一免血清對腐敗梭菌毒素的中和效價為1 MLD/0.1 mL，對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價為 5 MLD/0.1 mL;二免血清對腐敗梭菌毒素的中和效價為2 MLD/0.1 mL，對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價≥50 MLD/0.1 mL。二免后用1 MLD腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別攻擊，觀察期內(nèi)免疫組均100%保護，對照組均全部死亡(表3)。結(jié)果表明，Gcsa和Gcpe的共表達產(chǎn)物具有免疫原性，其滅活菌苗免疫家兔可以同時抵抗腐敗梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素攻擊。

表3 免疫血清中和試驗和攻毒保護試驗結(jié)果Tab 3 Results of immune serum neutralization and immune protection tests

3 分析與討論

許多研究將共表達方法應用于目的蛋白與分子伴侶一同表達，其目的或是為了改變蛋白的表達形式，或是為了提高表達量，亦或是為了優(yōu)化蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和增強生物活性等。Zhang Y［14］等用共表達載體pETDuet－1將霍亂毒素B亞單位CTB與分子伴侶SKP一同表達，提高了CTB的可溶性表達比例和生物活性;Liu XL［15］等將影響莽草酸代謝通路的多種蛋白酶進行不同形式的組合共表達，比較了不同蛋白酶的不同組合以及順序的差異對莽草酸產(chǎn)量的影響;Lu XY［16］等嘗試了多種分子伴侶以不同方式組合共表達用于提高1，2，4丁三醇的產(chǎn)量。共表達方法在新型疫苗的應用研究方面，Yu YZ［17］等將破傷風毒素受體蛋白(THc)與硫氧還原(Trx)共表達，優(yōu)化了蛋白構(gòu)想，提高了THc的免疫原性。另外，也有將抗原基因與免疫刺激因子共表達增強了免疫效果［18］。

很多梭菌外毒素是主要的致病性毒力因子和免疫保護性抗原，研究表明，通過基因工程大腸桿菌可以獲得具有免疫活性的重組外毒素。而將共表達方法應用于羊梭菌多聯(lián)新型候選疫苗的研制，可以實現(xiàn)多種抗原同步生產(chǎn)。韓廣偉［18］等共表達了同一種梭菌D型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和ε毒素兩種外毒素，純化后免疫小鼠，證實二者能同時發(fā)揮很好的免疫原性。本實驗獲得了2種梭菌，分別是腐敗梭菌α毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素的共表達，兩者同時保持其各自的生物活性，表達產(chǎn)物的免疫原性良好，一次免疫血清中和效價即可以達到《中國獸藥典》效力檢驗標準。在疫苗制備工藝方面，將含有重組抗原的工程菌菌液用甲醛滅活制成滅活疫苗，一方面甲醛在對工程菌滅活的同時，對毒素做了脫毒處理，保證了疫苗的安全;另一方面重組大腸桿菌本身在疫苗免疫過程中發(fā)揮了佐劑的作用，克服亞單位疫苗蛋白質(zhì)分子量小免疫刺激弱的不足［19］;同時簡化了疫苗制備的工藝，省去了細菌裂解、蛋白質(zhì)純化和包涵體復性等工序。此外，采用含乳糖的自誘導培養(yǎng)基誘導基因表達，代替了有毒性的IPTG，提高了疫苗的安全性。綜上，本試驗為梭菌病基因工程多價和多聯(lián)疫苗的開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。