陳漢鍶，林旭埜* ，田允波，齊冬梅，鄒偉斌，胡美容

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州5102252;2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬;即是作為全球豬業(yè)疾病的豬繁殖和呼吸綜合征(PRRS)的病原［1］。PRRSV于1987年在美國爆發(fā)隨后相繼在其他國家蔓延［2－3］;2006 年，PRRSV在中國爆發(fā)。PRRSV目前分為歐洲型(基因Ⅰ型)和美洲型(基因Ⅱ型)兩個(gè)血清型，中國主要流行的是美洲 型 PRRSV(NA － PRRSV)［4－5］。PRRSV基因組全長15 kb左右，至少由ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7 等 9 個(gè)開放閱讀框(ORF)組成，其中 ORF7編碼GP7蛋白(又名 N 蛋白)［6－8］。N 蛋白含量較高，占 PRRSV 病毒蛋白達(dá) 20%～40%［9］;N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，在感染后的早期階段就可刺激機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)期比較長的特異性抗體，這對PRRSV的早期診斷具有重要意義［10－12］。

ELISA方法具有成本低、安全、特異性和靈敏度較高、方便在基層推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，臨床檢測PRRSV抗體一般都是采用ELISA方法［13］。目前國內(nèi)普遍采用國外的ELISA試劑盒進(jìn)行PRRSV抗體的檢測，但價(jià)格昂貴，大大提高了PRRSV的流行病學(xué)監(jiān)測和診斷成本，不利于推廣。本試驗(yàn)以表達(dá)純化的PRRSV－N蛋白為包被抗原，優(yōu)化ELISA檢測方法的各種條件建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA檢測方法，通過進(jìn)一步優(yōu)化工藝，期望能開發(fā)出特異性、敏感性、穩(wěn)定性均較好的豬呼吸與繁殖綜合征抗體檢測間接 ELISA試劑盒，降低PRRSV的監(jiān)測和診斷成本。

1 材料

PRRSV－GDr180、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬肺炎支原體(MHP)、口蹄疫病毒(FMD)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，PRRSV－GDr180標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由廣東永順生物制藥股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室提供;HRP酶標(biāo)羊抗豬二抗購自abcam公司;酶標(biāo)板購自廣州潔特生物過濾股份有限公司;顯色底物購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 重組蛋白基因質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 N基因片段的 pcr擴(kuò)增 從 GenBank上下載PRRSV GD株(GenBank登錄號:EU825724)的基因組序列，設(shè)計(jì)一對引物并加上Bam HⅠ限制性酶切位點(diǎn)和Hin dⅢ限制性酶切位點(diǎn)，送上海生工合成引物后，以PRRSV病毒CDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的片段并回收保存。

2.1.2 pET32a－PRRSV－N 重組載體的構(gòu)建與鑒定利用Bam HⅠ和Hin dⅢ分別對pET32a(+)載體和回收的N基因片段進(jìn)行雙酶切，將酶切回收產(chǎn)物pET32a(+)載體和N基因片段用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后將細(xì)胞涂在氨芐霉素抗性的LA平板上，37℃過夜培養(yǎng)，從平板上挑取單菌落并過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，再把pET32a－PRRSV－N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后按同上的方式培養(yǎng)以及鑒定，并將陽性重組質(zhì)粒送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化

2.2.1 重組N蛋白表達(dá)及SDS－PAGE鑒定 取陽性重組質(zhì)粒的表達(dá)菌37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)5 h，10000 r/min離心收菌，超聲破碎，然后離心收集上清裂解液和沉淀，通過 SDS－PAGE電泳分析，確定重組蛋白是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)。

2.2.2 重組蛋白的 Ni－NTA樹脂純化 重組蛋白大量表達(dá)后，利用HIS蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，并用SDS－PAGE電泳鑒定純化的效果，用BCA試劑盒測定純化后的蛋白濃度。

2.3 重組蛋白的Western blot分析 純化的重組N蛋白，pET32a空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)過SDS－PAGE電泳，再轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，1%BSA 37℃封閉 1 h，PBST洗膜3次，加prrsv－GDr180陽性豬血清(1∶200稀釋)于37℃孵育1 h，洗膜3次，再加HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG(1∶10000稀釋)于室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后用HRP－DAB底物顯色試劑避光顯色10 min，觀察結(jié)果。

2.4 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 通用的ELISA程序 以抗原包被液稀釋抗原，100μL/孔4℃包被過夜;PBST洗板3次，加入封閉液200μL/孔，37℃封閉1 h，PBST洗板4次，拍干。加入稀釋的一抗血清100μL/孔，37℃反應(yīng)1 h，用 PBST洗板 4次;加入稀釋的酶標(biāo)抗體100μL/孔，37℃作用1 h，取出后用PBST洗液洗板5次;加入TMB顯色液100μL/孔，室溫避光反應(yīng)15 min;加入終止液50μL/孔;酶標(biāo)儀450 nm處讀取各孔讀數(shù)。

2.4.2 抗原最適包被濃度和待檢血清最佳稀釋濃度的確定 采用方陣滴定法，用包被液將純化后的N 蛋白梯度稀釋成 8.0、4.0、2.0、1.0 和 0.5 μg/mL，96孔板上每個(gè)梯度包被2列孔;橫向使用PBS將PRRSV GDr180株陰陽性血清作 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，使用酶標(biāo)抗體在建議工作濃度下進(jìn)行 ELISA測定，選擇陽性血清OD450mm值在1.0 左右，且陽性 OD450mm值/陰性 OD450mm值(P/N)比值最大時(shí)的抗原包被濃度和抗體稀釋度為最佳工作濃度。

2.4.3 包被方式的優(yōu)化 將確定的最適抗原濃度分別以4℃過夜、37℃作用1 h后4℃過夜、37℃作用2 h后4℃過夜和37℃作用2 h這4種包被條件進(jìn)行包被，然后進(jìn)行ELISA測定，以P/N最大者確定為最佳包被方式。

2.4.4 封閉液的選擇 用BSA和脫脂奶粉分別按1%、2%、5%三種濃度作為封閉液按照優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行ELISA測定，以P/N最大者確定為最佳封閉液。

2.4.5 抗原抗體最佳作用時(shí)間的確定 陰陽性血清在37 ℃分別按15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min進(jìn)行ELISA測定，以P/N最大者確定為一抗最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4.6 酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間確定 酶標(biāo)抗體在37 ℃按 15 min、30 min、45 min、60 min、75min、90 min進(jìn)行ELISA測定，以P/N最大者確定為酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4.7 酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化 酶標(biāo)抗體分別做1 ∶2500、1 ∶5000、1 ∶10000、1 ∶15000、1 ∶20000、1∶25000和1∶30000 7個(gè)稀釋度進(jìn)行ELISA測定，以P/N最大者確定為酶標(biāo)抗體工作液最佳反應(yīng)時(shí)間。2.4.7 TMB底物反應(yīng)時(shí)間的確定 加入TMB底物后，分別避光反應(yīng) 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min進(jìn)行ELISA測定，以P/N值最大者判定TMB底物最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5 臨界值的確定 用建立的ELISA檢測方法檢測52份已判定為PRRSV抗體陰性的豬血清(IDEXX試劑盒檢測確定)，根據(jù)陰性血清樣品OD450值計(jì)算其SP值的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以統(tǒng)計(jì)學(xué)原理確定ELISA陰陽性臨界值。為了減少誤差采用S/P值:S/P=(樣品測定孔OD450值－陰性對照孔平均OD450值)/(陽性對照孔平均OD450值－陰性對照孔平均OD450值)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，確定陰陽性臨界值，CP=x +3s;CN=x +2s，當(dāng)待測樣品的SP值≥CP時(shí)為陽性，＜CN時(shí)為陰性，介于兩者之間為可疑。

2.6 特異性檢測 利用優(yōu)化后的條件，對豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬支原體(MHP)、口蹄疫病毒(FMD)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性乙型腦炎(JE)等對進(jìn)行檢測，判定上述血清是否會與試劑盒的抗原起交叉反應(yīng)。

2.7 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 用同一批次的PRRSV N蛋白包被酶標(biāo)板，對16份血清進(jìn)行檢測，分別在第1、3、7天進(jìn)行測定，每份血清做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。2.8 批間重復(fù)試驗(yàn) 使用3批蛋白抗原分別包被ELISA板，對16份血清進(jìn)行檢測，每份血清做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值;計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，分析其批間重復(fù)性。

2.9 與同種其他試劑盒之間的比較 利用建立的ELISA方法對臨床送檢的196份豬血清進(jìn)行檢測，同時(shí)用商品化IDEXX PRRSV抗體檢測試劑盒做平行檢測，對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 重組蛋白基因質(zhì)粒的構(gòu)建 通過RT－PCR成功擴(kuò)增到N蛋白的基因片段，大小為372 bp，見圖1。重組陽性質(zhì)粒PCR鑒定，雙酶切均鑒定為陽性，通過比對測序結(jié)果，確定重組蛋白基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 N蛋白的基因片段凝膠電泳分析Fig 1 Gene fragment gel electrophoresis analysis of N protein

3.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE鑒定分析后，確認(rèn)重組蛋白是以可溶性蛋白方式存在的，通過Ni－NTA樹脂純化后，SDSPAGE鑒定分析后，確認(rèn)純化效果良好，并用BCA法測定純化后蛋白濃度，約為0.25 mg/mL。

3.3 重組蛋白的Western blot分析 重組蛋白在PVDF膜上，與PRRSV GD株高免陽性血清進(jìn)行反應(yīng)，顯色后 PVDF膜上可見到明顯的目的條帶(圖2)，表明重組蛋白跟PRRSV陽性血清能發(fā)生特異性反應(yīng)，有良好的反應(yīng)原性，可作為包被抗原進(jìn)行下一步方法的建立。

圖2 重組蛋白的Western blot分析Fig 2 Western blot analysis of recombinant protein

3.4 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

3.4.1 抗原最適包被濃度和待檢血清最佳稀釋濃度的確定 由表1可知，當(dāng)抗原包被濃度為1μg/mL，血清以1∶50稀釋時(shí)，陽性O(shè)D值在1.0左右，且P/N值較大。

3.4.2 包被方式的優(yōu)化 由表2可知，采取37℃2 h+4℃過夜包被時(shí)，陽性O(shè)D值接近1.0左右，P/N值最大，從而確定此為最佳包被方式。

3.4.3 封閉液的選擇 由表3可知，采用2%脫脂奶粉作為封閉液時(shí)，P/N值最大，故此為最佳封閉液。

3.4.4 抗原抗體最佳作用時(shí)間確定 當(dāng)血清反應(yīng)條件為37℃ 60 min時(shí)，P/N值最大，此時(shí)條件為最佳。

表1 抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果Tab 1 Optimized results of antigen coating concentration and serum dilution factor

表2 包被方式的優(yōu)化結(jié)果Tab 2 Optimized results of coating mode

表3 封閉液的優(yōu)化結(jié)果Tab 3 Optimized results of closed liquid

表4 抗原抗體作用時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Tab 4 Optimized results of antigen－antibody action time

3.4.5 酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間確定 由表5可知，當(dāng)二抗反應(yīng)條件為37℃ 90 min時(shí)，P/N值最大，此時(shí)條件為最佳。

3.4.6 酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化 由表6可知，當(dāng)稀釋度為15000倍時(shí)，P/N值最大，此時(shí)為最優(yōu)。

3.4.6 TMB底物反應(yīng)時(shí)間的確定 由表7可知，當(dāng)顯色條件為室溫下15 min時(shí)，P/N值最大，此時(shí)條件最佳。

3.5 臨界值的確定 用優(yōu)化的試劑盒檢測52份陰性血清及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中測的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 OD450值為 1.157，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450值為0.269;結(jié)合表8結(jié)果，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理確定其臨界值是:當(dāng)待測樣品的SP值≥0.172時(shí)為陽性，SP值＜0.085時(shí)為陰性，介于兩者之間為可疑。

表5 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Tab 5 Optimized results of enzyme－labeled antibody action time

表6 酶標(biāo)二抗工作濃度的優(yōu)化結(jié)果Tab 6 Optimized results of enzyme labeled antibody action time

表7 TMB底物反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Tab 7 Optimized results of TMB substrate reaction time

表8 52份陰性血清的檢測結(jié)果Tab 8 Detection results of 52 negative sera

3.6 特異性檢測 ELISA檢測偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬肺炎支原體(MHP)、口蹄疫病毒(FMD)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)果各個(gè)血清的 SP值均小于0.085(表9)，表明上述血清與建立的PRRSV抗體試劑盒不發(fā)生交叉反應(yīng)，證明建立的ELISA檢測方法特異性較好。

3.7 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 對于同一份血清，分別在第1、3、7天檢測，試驗(yàn)一共選取16份血清，結(jié)果見表10?？梢钥闯?，每份血清檢測結(jié)果的變異系數(shù)在1.0%～8.8%之間，均小于 10%，表明建立的 ELISA檢測方法批內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.8 批間重復(fù)試驗(yàn) 同一份血清均用3個(gè)不同批次蛋白包被的ELISA板進(jìn)行檢測，一共選取16份血清進(jìn)行檢測。表11結(jié)果顯示，其變異系數(shù)在1.1%～9.3%之間，均小于 10%，表明建立的 ELISA檢測方法批間穩(wěn)定性較好。

表9 特異性檢測結(jié)果Tab 9 Specific test result

表10 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 10 Repeated test results within the batch

3.9 與同種其他試劑盒之間的比較 利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法和IDEXX PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒同時(shí)檢測196份血清樣品，結(jié)果見表12。本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測方法檢測出陽性血清28份，陽性率為14.2%;用 IDEXX PRRSV ELISA試劑盒檢出陽性血清34份，陽性率為17.3%;兩者均檢出陽性的樣品為22份，均陰性的樣品156份，兩者的符合率為 91%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表12 兩種檢測方法的符合率比較Tab 12 Comparison of two test methods

4 分析與討論

目前常通過PRRSV血清抗體檢測及時(shí)進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測來控制該病。而在中和試驗(yàn)(SN)、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、間接免疫熒光(IFA)及多種ELISA抗體檢測方法中，ELISA是最為常用的PRRS抗體檢測方法。

本研究首次以PRRSV GDr180毒株作為模板，順利表達(dá)出了具有良好抗原性的PRRSV重組N蛋白。選用N蛋白作為ELISA方法的包被抗原是因?yàn)樵赑RRSV幾種蛋白中，PRRSV N蛋白在不同型毒株中有很高的同源性，是保守性很好的蛋白，以重組N蛋白作為診斷抗原建立的ELISA試劑盒，其生物安全性好，不會有散毒的危險(xiǎn)，相對生產(chǎn)成本較低，方便規(guī)?；a(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有比較清楚的遺傳背景、培養(yǎng)周期短、表達(dá)量高、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［14］。PET系統(tǒng)是在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白最高效、產(chǎn)量最高、成功率最高的表達(dá)載體。其是利用與啟動(dòng)子配套并且能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)，可以從各種基因生產(chǎn)大量的目的蛋白［15］。另外，pET－32a(+)載體的 SD 序列下游有TrxA基因與外源插入基因相連，外源基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物融合了TrxA基因編碼的硫氧還蛋白，從而不易被大腸桿菌蛋白酶降解，有利于外源蛋白的穩(wěn)定存在。融合蛋白含有His組氨酸標(biāo)簽結(jié)構(gòu)，可與鎳親和樹脂吸附，便于后續(xù)的蛋白質(zhì)純化。本研究即是用pet－32a(+)表達(dá)載體，順利表達(dá)出了具有良好抗原性的PRRSV重組N蛋白。

用重組N蛋白作為包被抗原，通過優(yōu)化ELISA檢測方法的各種條件，建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA檢測方法，建立的方法特異性試驗(yàn)檢測CSFV、JEV、FMDV、PRV、PPV、PCV2 等多種常見豬病病原的陽性血清均為陰性，表明建立的ELISA方法特異性很好，批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，表明建立的ELISA檢測方法穩(wěn)定性較好。而且同IDEXX公司ELISA檢測試劑盒進(jìn)行了對比，相對特異性高達(dá)96%，兩者之間符合率達(dá)到91%;國內(nèi)也有相應(yīng)的試劑盒已開發(fā)出來，但與IDEXX試劑盒相比，主要問題是批間差異較大，穩(wěn)定性不佳，包被蛋白的純度直接影響方法的特異性，不同批次的包被蛋白的純度差異是影響批間差異的主要因素，所以優(yōu)化蛋白純化條件及確定穩(wěn)定的蛋白純化工藝可以有效解決目前試劑盒存在的主要問題，針對本次建立的方法，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，會在蛋白純化，抗原保護(hù)劑，抗體稀釋液等等關(guān)鍵工藝上進(jìn)行篩選優(yōu)化，期望能使建立的方法在特異性，穩(wěn)定性方面有所提升，以開發(fā)出發(fā)穩(wěn)定性更好，靈敏性更強(qiáng)，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確的PRRSV抗體檢測試劑盒。