劉 郁，張靜靜，呂榮祥，王文盛

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動功能進(jìn)行性減退，其發(fā)病機(jī)制與腦黑質(zhì)或大腦基底神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡或功能異常有關(guān)[1]，且多數(shù)PD患者表現(xiàn)為神經(jīng)元病理性蛋白質(zhì)累積[2]。盡管如此，PD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全闡明，深入開展PD相關(guān)的分子標(biāo)志物研究對于該病的早期診斷以及治療研究至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，血清來源的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，因其穩(wěn)定性好、不易降解、取材方便，可為疾病診斷、治療及基礎(chǔ)研究提供大量有價值的信息，已經(jīng)成為多種疾病研究的熱點(diǎn)[3]，但其在PD中的研究卻十分有限。

本研究通過表達(dá)譜芯片分析了PD患者與健康個體血清EVs中mRNA表達(dá)差異，探索存在于PD患者血清EVs中新的異常表達(dá)基因，為PD相關(guān)的診斷和神經(jīng)保護(hù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月～2017年11月于我院神經(jīng)內(nèi)科確診的PD患者22例，健康對照個體16例。PD患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2015年國際運(yùn)動障礙協(xié)會的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)無嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病和其他內(nèi)科合并癥；(3)無精神類疾病，能夠配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)由于藥物、創(chuàng)傷或其他腦血管疾病等已知原因引起的繼發(fā)性PD；(2)近期接受過藥物治療的PD患者；(3)早發(fā)性帕金森患者(起病年齡≤50歲)。本研究經(jīng)寧波市第六醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 血清胞外囊泡提取、鑒定及RNA提取 收集受試者外周血5 ml，待血液凝固后3000 rpm離心10 min，小心將上清吸出備用。血清EVs及其RNA提取采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒(QIAGEN)，具體方法參照生產(chǎn)商說明書。為觀察血清EVs形態(tài)，將Buffer XE洗脫下來的外泌體滴加在載樣銅網(wǎng)上，待其干燥后用1%的乙酸雙氧鈾負(fù)染，負(fù)染后用透射電子顯微鏡觀察EVs結(jié)構(gòu)。

1.3 mRNA表達(dá)譜芯片分析 PD患者及健康個體血清EVs來源的RNA經(jīng)定量后，采用Affymetrix GeneChip?Human Genome U133 Plus 2.0芯片(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行mRNA差異表達(dá)分析，每個RNA樣品上樣量為300 ng，具體操作方法參見生產(chǎn)商提供的說明書及早期報道[5]。R軟件對PD患者及健康個體血清EVs mRNA表達(dá)水平進(jìn)行差異分析，log2Fold Change(FC)>2或<-2，且P<0.01時，認(rèn)為差異基因具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 實時定量PCR反應(yīng) 實時定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)用于差異表達(dá)基因驗證。引物序列經(jīng)Primer premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計后，由Invitrogen公司(Thermo Fisher Scientific)合成。M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程公司)用于RNA反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物cDNA作為RT-PCR模板用于基因表達(dá)分析。使用MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)試劑，以cDNA為模板，采用ABI 7500實時PCR檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行實時定量PCR，GAPDH作為內(nèi)對照，以2-△△CT進(jìn)行相對定量分析，所有實驗獨(dú)立重復(fù)3次，以確定EVs中mRNA相對水平。

2 結(jié) 果

2.1 受試者一般資料比較 健康對照個體中，男9例(56.3%)，女7例(43.8%)，平均年齡(58.26±3.23)歲；PD患者中，男10例(45.5%)，女12例(54.5%)，平均年齡(57.51±2.19)歲。兩組受試者性別(χ2=0.432，P=0.511)及年齡(t=0.5847，P=0.575)間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩組間具有可比性。

2.2 PD患者血清EVs中46個mRNA異常表達(dá) EVs洗脫液經(jīng)負(fù)染后，可在透射電子顯微鏡下觀察到直徑約30～100 nm的小囊泡，結(jié)果證實已從受試者血清中提取到EVs(見圖1)。經(jīng)表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)，與健康對照個體(n=6)相比，PD患者(n=6)血清EVs中有46個mRNA表達(dá)水平存在顯著差異，其中26個mRNA顯著上調(diào)，20個mRNA顯著下調(diào)(2

2.3 PD患者血清EVs中8個mRNA持續(xù)異常表達(dá) qRT-PCR進(jìn)一步驗證上述差異mRNA在健康對照個體(n=16)和PD患者(n=22)血清EVs中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照個體相比，BCAR3(t=10.58，P=0.0005)、SCEL(t=7.517，P=0.0017)、KLHK12(t=3.988，P=0.0163)、GIPR(t=9.601，P=0.0007)、DZANK1(t=5.008，P=0.0074)在PD患者血清EVs中持續(xù)上調(diào)；而LIFR(t=4.514，P=0.0107)、ANKRD53(t=11.89，P=0.0003)和TMEM100(t=8.561，P=0.0010)在PD患者血清EVs中持續(xù)下調(diào)(見圖3A、B)。

2.4 BCAR3、SCEL及LIFR特異性存在于PD患者血清EVs中 為明確持續(xù)差異表達(dá)的8個mRNA是否特異存在于PD患者血清EVs中，qRT-PCR分別檢測了這些mRNA在PD患者血清EVs和去EVs血清中的相對水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與去EVs的血清相比，BCAR3和SCEL在PD患者血清EVs中表達(dá)水平顯著上調(diào)(t=3.614，P=0.0225；t=4.595,P=0.0101)，LIFR在PD患者血清EVs中表達(dá)水平顯著下調(diào)(t=24.34，P<0.0001)(見圖4)。ANKRD53、TMEM100、GIRP、DZANK1及KLHL12在PD患者血清EVs和去EVs的血清間表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果證實，BCAR3、SCEL及LIFR特異性存在于PD患者血清EVs中。

表1 PD患者血清EVs中顯著差異表達(dá)的前20個基因

基因名變化倍數(shù)(log2FC)平均表達(dá)量t值P值DNAJC1PLAG1F10112ITM2CSDCCAG3GEMIN6LIFRANKRD53CADPSBCAR3TMEM100SCELLIN28ATAF7LKLHL12GIPRDZANK1NAG18ZNF135-2.0601923582.6293150593.130124828-2.026310693-2.2186852652.448153441-2.5354686642.121684895-2.2376487792.583387417-2.291713332.085607137-2.024172141-2.0037439472.2145528842.2811482122.3717337032.1880041642.0953708325.0851773.0699282.6108355.0974374.6403064.1965573.1601443.8547644.5678183.6105753.4621092.8638324.3621084.3032115.3507085.2638763.8532283.0692441.897475-9.086648.2640596.147836-5.90764-5.292725.175882-5.075074.759949-4.738454.68193-4.653554.535008-4.30904-4.287284.2441354.1740124.1245424.0281073.8648326.48E-071.84E-063.88E-055.69E-050.0001580.0001920.0002290.0003970.0004130.0004560.000480.0005940.0008940.0009310.0010070.0011460.0012550.00150.002034

圖1 典型的血清EVs電鏡圖

圖2 健康個體及PD患者血清EVs中差異基因熱圖

圖3 qRT-PCR驗證健康個體及PD患者血清EVs中差異mRNA的表達(dá)*P<0.05

圖4 持續(xù)差異mRNA在PD患者血清EVs及去EVs血清中的表達(dá)*P<0.05

3 討 論

本研究采用表達(dá)譜芯片對比分析了PD患者和健康個體血清EVs中差異表達(dá)的mRNA，實時定量PCR對差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達(dá)水平持續(xù)下調(diào)。其中，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs和去EVs的血清中存在顯著差異。本研究結(jié)果首次證實，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs中表達(dá)水平異常改變，且特異存在于PD患者的EVs中。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，探索與PD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子靶標(biāo)可以增強(qiáng)我們對疾病的認(rèn)識[6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)血清EVs可以遞送大量的生物活性物質(zhì)到受體細(xì)胞，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。這些生物活性物質(zhì)包括miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等，其中以miRNA含量最多，研究最為廣泛[7]。越來越多的與PD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的EVs內(nèi)容物逐漸被發(fā)現(xiàn)[8]。例如，PD患者尿液EVs中Ser(P)-1292 LRRK2水平升高，并與患者的意識障礙程度和自理能力密切相關(guān)[9]。Cao等人研究發(fā)現(xiàn)PD患者血清EVs中miR-19b表達(dá)水平下調(diào)，miR-195和miR-24表達(dá)水平上調(diào)，它們在血清中的表達(dá)水平可能有助于PD診斷[10]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液EVs中含有高水平的α-突觸核蛋白，被受體細(xì)胞吸收后可引起細(xì)胞毒性[11,12]。然而，有關(guān)PD患者血清EVs中mRNA差異表達(dá)的研究則十分有限。本研究首次通過表達(dá)譜芯片分析了PD患者血清EVs中差異表達(dá)的mRNA，經(jīng)PCR驗證后發(fā)現(xiàn)，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達(dá)水平上調(diào)，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達(dá)水平下調(diào)。

體液EVs RNA已經(jīng)成為多種疾病診斷及預(yù)后研究的熱點(diǎn)，特別是血清EVs中的RNA因其具有較好的穩(wěn)定性且取材方便，已具備較好的臨床應(yīng)用前景[13]。然而，以往報道的血清標(biāo)志物主要以游離于血清中的分子為主，本研究則重點(diǎn)關(guān)注了PD和正常對照個體血清EVs中差異表達(dá)的mRNA。為了進(jìn)一步證實這些差異表達(dá)的mRNA是否特異地存在于血清EVs中，我們分別檢測了這些差異基因在PD患者血清EVs以及去除EVs后血清中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌抗雌激素藥物耐藥性基因3(Breast cancer anti-estrogen resistance gene 3，BCAR3)和Sciellin蛋白(SCEL)在PD患者血清EVs中的表達(dá)水平顯著高于去除EVs的血清，而白血病抑制因子受體(LIF receptor alpha，LIFR)在PD患者血清EVs中的表達(dá)水平則顯著低于去EVs的血清。由此證實，BCAR3、SCEL及LIFR是特異性地存在于PD患者血清EVs中的差異表達(dá)基因。

由于PD的發(fā)生發(fā)展與大腦神經(jīng)元損傷密切相關(guān)[14]，而血清EVs又非常容易穿過血腦屏障將分子特異性地遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]，因此EVs中異常表達(dá)的分子很可能通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與PD進(jìn)展。然而，目前有關(guān)BCAR3、SCEL及LIFR在PD發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究十分有限。LIFR主要參與細(xì)胞分化、增殖和存活，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用，并在PD患者海馬和扣帶回部位表達(dá)水平顯著上調(diào)[16]，但其影響PD進(jìn)展的可能機(jī)制尚未報道。本研究發(fā)現(xiàn)，LIFR表達(dá)水平在PD患者血清EVs中顯著下調(diào)，但其功能仍有待于進(jìn)一步研究。BCAR3可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞雌激素非依賴性增殖，與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17,18]。同樣，有研究發(fā)現(xiàn)SCEL低表達(dá)與結(jié)直腸癌的遷移及侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)[19]。然而，BCAR3和SCEL與PD發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系目前尚未被報道。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達(dá)水平上調(diào)，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達(dá)水平下調(diào)。其中，BCAR3、SCEL及LIFR是特異存在于PD患者血清EVs中的差異表達(dá)基因。本研究也存在一定的局限性，例如缺少機(jī)制研究，尚不能進(jìn)一步明確上述差異表達(dá)的mRNA在PD發(fā)生發(fā)展中的具體作用，今后仍需在臨床水平、動物水平及細(xì)胞分子水平進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。然而，目前的結(jié)果可以明確血清EVs中BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者中異常表達(dá)，可能與PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究結(jié)果將為EVs相關(guān)PD早期診斷以及神經(jīng)保護(hù)研究提供了初步的理論依據(jù)。