王欣榮 張雪霞 褚以文 鄭智慧 茍小軍 路新華

(抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052；2 華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，石家莊 050015)

雷帕霉素(rapamycin, RPM)是一種具有免疫抑制活性的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。起初被作為低毒性的抗真菌藥物，1989年開始把雷帕霉素作為治療器官移植的排斥反應(yīng)，是一種療效好、低毒、無(wú)腎毒性的新型免疫抑制劑[1]?？茖W(xué)家近期發(fā)現(xiàn)它另外一種用途：可用于治療阿爾茨海默癥(老年性癡呆)。目前雷帕霉素已被成功開發(fā)為新型強(qiáng)效的免疫抑制劑，用于器官移植抗排斥反應(yīng)；以及新型包衣涂層藥物，用于涂層支架，防止心血管再狹窄；以雷帕霉素為基本結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行衍生物的藥物合成研究，使該類藥物在抗腫瘤領(lǐng)域已有多個(gè)藥物上市[2-3]。但由于發(fā)酵水平低、生產(chǎn)成本高，很多患者在經(jīng)濟(jì)上無(wú)法接受，因而，其推廣應(yīng)用受到了一定的限制。

通過(guò)物理或化學(xué)的條件進(jìn)行隨機(jī)的誘變是改良菌株的經(jīng)典方法，雖然有效但通常需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源?！昂颂求w工程”是由日本國(guó)家食品研究所的Kozo教授[4]首先提出來(lái)核糖體工程(ribosome engineering)這一概念，它是以核糖體蛋白結(jié)構(gòu)上的突變對(duì)微生物次級(jí)代謝調(diào)控作用的影響機(jī)制出發(fā)建立起來(lái)的微生物推理育種的新方法。常用于抗性篩選的抗生素有多種，其中以鏈霉素、利福平進(jìn)行篩選的效果最佳[5-6]。

單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物(one strain many compounds,OSMAC)策略是通過(guò)改變培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、改變培養(yǎng)狀態(tài)、表觀遺傳調(diào)控及添加酶抑制劑等方法，充分挖掘微生物合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力[7]。雷帕霉素產(chǎn)生菌包括吸水鏈霉菌和游動(dòng)放線菌等，它們的共同特點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中含有大量的棉籽餅粉、黃豆餅粉和玉米漿等復(fù)雜氮源，帶來(lái)了巨大的環(huán)保壓力。

本研究以游動(dòng)放線菌SIIA-1602作為出發(fā)菌株，首次將亞硝基胍、核糖體工程育種和常壓室溫等離子體方法結(jié)合，用于高產(chǎn)雷帕霉素菌株的選育，在篩選培養(yǎng)基中加入賴氨酸或哌可酸，以期篩選得到發(fā)酵水平有較大提高，氮源利用更加高效的新菌株，提高雷帕霉素的產(chǎn)量，以便降低生產(chǎn)成本，減少?gòu)U物排放，滿足市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

出發(fā)菌株：游動(dòng)放線菌SIIA-1602(ActinoplanesSIIA-1602)，由本研究組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

平板及斜面培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母提取物，可溶性淀粉，瓊脂等；pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母提取物，可溶性淀粉，玉米漿，氯化鈉，CaCO3等，自來(lái)水配制，pH6.8～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：(1)對(duì)照配方(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉10.0，玉米漿10.0，黃豆餅粉20.0，氯化鈉2.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來(lái)水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

(2)配方1(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉10.0，玉米漿5.0，黃豆餅粉4.0，氯化鈉2.0，賴氨酸8.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來(lái)水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

(3)配方2(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉7.0，玉米漿5.0，黃豆餅粉5.0，哌可酸1.0，氯化鈉2.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來(lái)水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：鏈霉素購(gòu)自Sigma公司；亞硝基胍，TCI；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，雷帕霉素對(duì)照品購(gòu)自美國(guó)藥典委員會(huì)。

儀器：立式蒸氣壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠； ARTP誘變育種儀，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；Agilent technologies 1200高效液相色譜儀、搖床(美國(guó)NBS)；10t微生物發(fā)酵罐系統(tǒng)(華北制藥工程裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

斜面及平板培養(yǎng)方法：無(wú)菌環(huán)取菌種涂布于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)9～12d。

種子培養(yǎng)方法：從活化的菌種斜面上挑取一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)80h。

搖瓶發(fā)酵方法：將培養(yǎng)80h的種子以6%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)168h。

10t發(fā)酵罐發(fā)酵方法：將培養(yǎng)60h的種子液(培養(yǎng)基以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.05%的泡敵)以5%接種量接入發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.05%的泡敵)，發(fā)酵罐裝液量為7000L，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度120r/min，通氣量為7000L/min，培養(yǎng)周期6～8d。

1.2.2 菌懸液的制備

取新鮮斜面1支，加入滅菌的0.85%生理鹽水10mL，用竹簽刮下菌絲，制成菌懸液，玻璃珠30min，220r/min打碎，過(guò)濾，收集菌懸液，控制濃度為107CFU/mL。

1.2.3 NTG誘變

NTG用丙酮溶解，配制成濃度為10mg/mL。取1mL單孢子懸液，加入NTG母液，使終濃度分別為0.05和0.1mg/mL，震蕩處理時(shí)間為25、50和75min，加入硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，將經(jīng)誘變處理的菌懸液稀釋并涂布到平板培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)11d，計(jì)算致死率，并挑選單菌落斜面培養(yǎng)后采用3種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，高產(chǎn)菌株自然分離后進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4 鏈霉素抗性誘變

以NTG高產(chǎn)突變株為出發(fā)菌株，將新鮮菌懸浮液涂布于鏈霉素濃度30～150mg/mL的平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)11d， 觀察生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)死亡率；挑取不同劑量下存活菌落繼續(xù)培養(yǎng)11d，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵檢測(cè)，考察菌種的突變傾向，確定最適篩選壓力。在較適鏈霉素抗性篩選壓力下篩選抗性菌株，斜面培養(yǎng)后采用3種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，高產(chǎn)菌株自然分離后進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.5 ARTP誘變[8]

將經(jīng)上級(jí)誘變篩得菌株的單孢子懸液涂布于待照射載片上，按照ARTP生物誘變育種機(jī)的操作流程，以氦氣為工作氣體，點(diǎn)樣量為10μL，風(fēng)干時(shí)間20s，設(shè)定功率為120W，通氣量為10SLM，等離子體發(fā)射源與樣品間距離為2mm。處理時(shí)間為0、30、60、90、120、150和180s，將誘變處理后的孢子洗下，稀釋并涂布到固體平板培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)11d，計(jì)算致死率，并挑選單菌落斜面培養(yǎng)后采用3種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，高產(chǎn)菌株自然分離后進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性的考察

將篩選出的高產(chǎn)菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，每代菌株轉(zhuǎn)接3種發(fā)酵培養(yǎng)基，檢測(cè)雷帕霉素的產(chǎn)量，并對(duì)各代菌株的雷帕霉素產(chǎn)量進(jìn)行分析比較，檢驗(yàn)菌株的遺傳性狀是否穩(wěn)定。

1.2.7 雷帕霉素效價(jià)分析方法[9]

取發(fā)酵液3mL，加入丙酮7mL混勻，超聲處理30min，12000r/min離心，取上清液進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：C18(250mm×4.6mm, 5μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇:乙腈:水=60:25:30(V:V:V)，柱溫50℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)277nm，進(jìn)樣量10μL。

1.2.8 氨基氮測(cè)定

準(zhǔn)確吸取2.0mL濾液于250mL三角燒瓶中，加10mL純水及0.1%甲基紅指示劑2～3滴，加0.1mol/L HCl 1～2滴至紅色，用0.02mol/L NaOH回滴定至黃色，加18%甲醛4mL，搖勻，放置5min，加酚酞2～3滴，以0.02mol/L NaOH滴定，滴至微紅色為終點(diǎn)(顏色的變化順序：紅→黃→微紅)，記錄NaOH毫升數(shù)，根據(jù)所耗NaOH毫升數(shù)，查表即得氨基氮的含量。

2 結(jié)果

2.1 NTG誘變

在0.05和0.1mg/mL的誘變劑量下，累計(jì)處理75min，致死率均達(dá)到80%以上(表1)。經(jīng)誘變處理后挑取的單菌落200株經(jīng)3種培養(yǎng)基初篩，0.1mg/mL NTG誘變50min，正突變率最高為32%。選取30株正突變高于15%的菌株經(jīng)復(fù)篩后得到突變菌株N-092，采用不加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵效價(jià)達(dá)到486μg/mL，較SIIA-1602提高了23.0%；而采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基分別達(dá)到467和440μg/mL，較SIIA-1602分別提高了37.4%和57.1%。

2.2 鏈霉素抗性突變株選育

在鏈霉素30～150mg/mL范圍內(nèi)觀察游動(dòng)放線菌SIIA-1602的生長(zhǎng)表現(xiàn)。菌落在30～50mg/mL劑量以內(nèi)死亡率較小；在70～90mg/mL范圍內(nèi)死亡率逐漸增大；120mg/mL以上菌落生長(zhǎng)極微弱，僅有極個(gè)別針點(diǎn)狀菌落生長(zhǎng)，不能確定是否是由于涂布不均勻或其它原因而存活，故而不進(jìn)行篩選。

表1 NTG誘變致死率結(jié)果Tab. 1 The fatality rate curve of NTG mutagenesis

在鏈霉素50～90mg/mL的劑量范圍內(nèi)，挑取不同菌型共120株在3種發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)，考察雷帕霉素發(fā)酵單位，統(tǒng)計(jì)突變率(發(fā)酵單位變化超過(guò)±10%視為發(fā)生突變)。實(shí)驗(yàn)顯示鏈霉素抗性劑量達(dá)70mg/mL時(shí)正向突變較好。

選取25株正突變高于15%的菌株經(jīng)復(fù)篩后得到突變菌株SN-187，采用不加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵效價(jià)達(dá)到548μg/mL，較N-092提高了15.4%；而采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基分別達(dá)到562和522μg/mL，N-092分別提高了23.4%和19.5%。

2.3 ARTP誘變

菌株致死率與等離子照射時(shí)間呈正相關(guān)，ARTP處理90s，致死率為90%左右，處理時(shí)間為120s時(shí)，致死率達(dá)到100%)。經(jīng)誘變處理后挑取的單菌落120株經(jīng)3種發(fā)酵培養(yǎng)基初篩，ARTP處理90s，正突變率最高為33.6%。選取35株正突變率高于15%的菌株經(jīng)復(fù)篩后得到突變菌株ASN-256，采用不加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵效價(jià)達(dá)到615μg/mL，較SN-187提高了13.6%；而采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基分別達(dá)到706和697μg/mL，較SN-187分別提高了26.2%和34.0%。

2.4 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)3輪誘變篩選出的高產(chǎn)菌株ASN-256在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，其產(chǎn)孢速度基本一致；對(duì)照配方組、賴氨酸組和哌可酸組雷帕霉素的產(chǎn)量分別穩(wěn)定在595～618、698～715和690～706mg/L，其結(jié)果見(jiàn)表2，表明該菌株的遺傳性能基本穩(wěn)定。

2.5 10t發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果

采用突變株ASN-256按照“1.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行了10t發(fā)酵罐發(fā)酵研究，采用添加哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在48和96h補(bǔ)加了哌可酸0.05%，其發(fā)酵過(guò)程中氨基氮和生物量變化曲線如圖1，其發(fā)酵單位達(dá)到1250mg/L，比搖瓶發(fā)酵水平進(jìn)一步增加了78.6%。菌株SIIA-1602采用在對(duì)照配方的發(fā)酵過(guò)程中，氨基氮和生物量變化曲線如圖1，其發(fā)酵單位為439mg/L。在發(fā)酵過(guò)程中，哌可酸組的氨基氮水平和生物量約為對(duì)照組的50%和60%，放罐時(shí)由于菌絲開始自溶，對(duì)照組的氨基氮顯著增加，而哌可酸組也略有上升。由于哌可酸組發(fā)酵單位明顯提高，且最后一天單位漲幅減緩，可以考慮提前一天放罐，廢液中的氨氮排放將大幅降低。經(jīng)放罐粗提，哌可酸組產(chǎn)生的菌渣量為345kg，約為對(duì)照組的50%。

表2 A-256的遺傳穩(wěn)定性Tab. 2 The genetic stability of ASN-256

3 結(jié)論與討論

以游動(dòng)放線菌SIIA-1602為出發(fā)菌株，采用NTG誘變得到突變株N-092，發(fā)酵水平提高23.0%，采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基則分別提高37.4%和57.1%；采用鏈霉素抗性誘變N-092，得到多株高產(chǎn)菌株，其中SN-187發(fā)酵水平較原出發(fā)菌株N-092提高15.4%，采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基分別提高23.4%和19.5%；采用ARTP育種誘變SN-187，得到多株高產(chǎn)菌株，其中ASN-256發(fā)酵水平較原出發(fā)菌株SN-187提高13.6%，采用刪減氮源添加前體物質(zhì)賴氨酸或哌可酸的發(fā)酵培養(yǎng)基分別提高26.2%和34.0%。出發(fā)株游動(dòng)放線菌SIIA-1602經(jīng)過(guò)NTG誘變、鏈霉素抗性和ARTP誘變篩選得到的突變株ASN-256，其發(fā)酵水平提高了55.7%，發(fā)酵培養(yǎng)基刪減氮源添加了賴氨酸和哌可酸后，發(fā)酵水平提高分別107.6%和148.9%。

在10t發(fā)酵罐通過(guò)流加哌可酸，使菌種ASN-256發(fā)酵單位進(jìn)一步提高到1250mg/L，是菌株SIIA-1602采用配方1的發(fā)酵水平的2.85倍。菌種ASN-256總氮源使用量減少50%，放罐時(shí)氨基氮排放僅為菌株SIIA-1602的一半，菌渣量也顯著降低。由于發(fā)酵單位大幅提高，提前一天放罐則可以減少菌絲自溶帶來(lái)的廢液氨氮增加，進(jìn)一步降低發(fā)酵廢液的氨基氮水平，使氨氮保留于菌渣，通過(guò)其它方式處理。

誘變育種是最常用的有效育種手段，采用多種誘變劑誘變育種，進(jìn)行積累誘變，大大增加了菌株的突變頻率。選擇氨基糖甙類抗生素作為篩選壓力，試圖獲得導(dǎo)致核糖體蛋白發(fā)生突變，同時(shí)又能夠激活菌種產(chǎn)抗能力的變異株。根據(jù)雷帕霉素的生物合成途徑研究可知，雷帕霉素由6個(gè)乙酸和7個(gè)丙酸單位組成聚酯環(huán)，合成起始單位為環(huán)外的環(huán)己烷，來(lái)源于莽草酸；環(huán)上的哌可酸來(lái)源于賴氨酸[10-11]。發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)雜的有機(jī)氮源可以提供賴氨酸，但也造成了氮源的浪費(fèi)，使培養(yǎng)基過(guò)于豐富，加大了后期發(fā)酵廢液的環(huán)保處理壓力。因此，采用化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的分子設(shè)計(jì)育種方法，結(jié)合OSMAC策略中改變營(yíng)養(yǎng)成分的方法，通過(guò)改變篩選培養(yǎng)基，減少?gòu)?fù)雜氮源，加入賴氨酸或直接添加哌可酸，有可能篩選到直接利用哌可酸合成雷帕霉素的菌種，減少氮源的使用。根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑，在誘變篩選發(fā)酵過(guò)程中添加前體作為篩選壓力，試圖解除和緩解產(chǎn)物合成的限速步驟，可以進(jìn)一步快速獲得解除終產(chǎn)物反饋抑制突變株。本研究將抗性誘變應(yīng)用于雷帕霉素生產(chǎn)菌株，結(jié)合NTG和ARTP誘變，結(jié)合OSMAC策略篩選得到具備鏈霉素抗性，氮源利用率顯著提高的高產(chǎn)菌株。該菌株在生產(chǎn)能力、氮源利用和傳代穩(wěn)定性方面都獲得了明顯的改善和提高；發(fā)酵組分無(wú)明顯變化，對(duì)后續(xù)工藝未產(chǎn)生不利影響。

經(jīng)過(guò)誘變得到的突變株ASN-256雷帕霉素產(chǎn)量大幅提升，其發(fā)酵廢液中氨基氮水平大幅降低，菌渣量也減少了50%，顯著減少了環(huán)保處理的費(fèi)用，降低了生產(chǎn)成本。在環(huán)境污染問(wèn)題日益突出的今天具有較大的意義，符合節(jié)能減排的社會(huì)需求。