趙 成 ，陳雪芳 ，熊 蓮 ，郭海軍 ，黃前霖 ，黃 超 ?，陳新德 ?

（1.中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；2.中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.廣東省新能源和可再生能源研究開(kāi)發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

0 引 言

微生物油脂[1]是微藻、酵母、真菌、細(xì)菌等微生物在體內(nèi)合成的甘油酯，其組成與植物油脂類(lèi)似。與植物油脂相比，微生物油脂的生產(chǎn)具有不受氣候、季節(jié)限制，占地少，所需人力較少等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油的理想原料[2-4]。通常，高效篩選高油脂含量菌株是微生物油脂能源化利用的基礎(chǔ)，而如何測(cè)量微生物的油脂含量是篩選高油脂含量菌株不可缺少的步驟。目前，傳統(tǒng)氯仿/甲醇重量分析方法是測(cè)定微生物油脂含量最常用方法[5-6]，具有準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，然而其分析過(guò)程繁瑣，需要消耗大量的時(shí)間，并且還需要消耗大量的有機(jī)溶劑，易造成二次污染等問(wèn)題。這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)快速、環(huán)保的方法用于測(cè)定微生物油脂含量對(duì)微生物油脂能源化利用具有重要意義。近年來(lái)，細(xì)胞熒光法因檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確（精確到單個(gè)細(xì)胞）、操作簡(jiǎn)便、污染少（僅需痕量的熒光染料）等優(yōu)點(diǎn)，在高通量篩選高油脂含量微生物上潛力巨大，備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[7-9]。其中，熒光染料的選擇與應(yīng)用是細(xì)胞熒光法應(yīng)用最為重要的部分，而在眾多染料中，以尼羅紅與4,4-二氟- 1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二氮雜-s-茚烯（4,4-difluoro- 1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene,BIODIPY 505/515）這兩種脂溶性染料應(yīng)用最為廣泛，是目前微生物油脂定性與定量分析的理想染料。因此，本文以尼羅紅與BODIPY 505/515為例，系統(tǒng)介紹微生物油脂的細(xì)胞熒光分析方法，包括應(yīng)用范圍、發(fā)展歷史、影響因素、存在問(wèn)題以及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)等。

1 尼羅紅及其在微生物油脂測(cè)定中的應(yīng)用

1.1 尼羅紅的結(jié)構(gòu)及其光學(xué)性質(zhì)

尼羅紅是一種親脂、疏水的非極性惡嗪類(lèi)熒光染料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，化學(xué)式和光譜特性如表1所示。尼羅紅易溶于丙酮、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）等有機(jī)溶劑，在水溶液中的溶解度比較低，同時(shí)，會(huì)與水分子發(fā)生相互作用（一般為氫鍵作用）而發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象[10]。此外，尼羅紅分子苯環(huán)上含有羰基等極性取代基，使其對(duì)溶劑的極性環(huán)境比較敏感；在不同極性溶劑中，其最大熒光強(qiáng)度差別較大，由于在不同的溶劑中存在不同的化學(xué)鍵作用，染色劑分子會(huì)發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致激發(fā)光譜曲線發(fā)生一定的移動(dòng)（紅移或藍(lán)移），熒光淬滅速率也會(huì)有所不同[11-12]，會(huì)對(duì)熒光分析結(jié)果產(chǎn)生一定影響。同時(shí)，當(dāng)溶劑的極性減弱時(shí)，尼羅紅染色劑激發(fā)光譜的峰值會(huì)發(fā)生藍(lán)移，其原因可能是：（1）在激發(fā)光照射時(shí)，尼羅紅分子偶極矩發(fā)生改變，分子發(fā)生熱運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致其光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化；（2）尼羅紅分子內(nèi)電荷的轉(zhuǎn)移，使得分子的剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致分子表面的活性基團(tuán)發(fā)生改變，進(jìn)而光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化；（3）在染色過(guò)程中，尼羅紅染色劑與細(xì)胞內(nèi)的一些非脂類(lèi)的疏水性物質(zhì)（例如蛋白質(zhì)等）結(jié)合發(fā)生聚集沉降[13-15]。研究表明，在激發(fā)波長(zhǎng)（λex）小于570 nm時(shí)，尼羅紅可選擇性地與細(xì)胞內(nèi)的中性脂質(zhì)結(jié)合，發(fā)出金黃色的熒光；激發(fā)波長(zhǎng)（λem）在 570～590 nm 時(shí)，尼羅紅能與細(xì)胞內(nèi)所有脂質(zhì)結(jié)合，發(fā)出橘紅色熒光；而當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)大于590 nm時(shí)，尼羅紅則失去對(duì)脂質(zhì)的敏感性[16]。由此可以看出，尼羅紅對(duì)細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)具有較強(qiáng)的特異性，因而在微生物中性脂質(zhì)的測(cè)定時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)一般選在570 nm處。

圖1 尼羅紅與BODIPY 505/515染色劑結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Nile red and BODIPY 505/515

表1 中性脂質(zhì)染色劑尼羅紅和BODIPY 505/515的分子和光譜特性[8]Table 1 Characteristics of Nile red and BODIPY 505/515 for neutral lipid fluorescent dyeing

1.2 尼羅紅熒光分析方法的發(fā)展

尼羅紅熒光分析微生物油脂含量的方法由來(lái)已久。早在1985年，F(xiàn)OWLER等[17]從獼猴的身體上提取相應(yīng)的組織細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等對(duì)染色后的組織細(xì)胞脂質(zhì)的形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)分布情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明尼羅紅染色劑比其他疏水性染色劑具有更高的選擇性，可以更清楚地觀察到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布情況。隨后，1987年COOKSEY等[18]以Amphora coffeaeformis、Naviculasp.和Tropidoneissp.等微藻為研究對(duì)象，通過(guò)一定的方法對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再經(jīng)尼羅紅熒光染料染色后，并在激發(fā)波長(zhǎng)為488～525 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為 570～600 nm 時(shí)，能觀察到較強(qiáng)的熒光現(xiàn)象，同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定的熒光強(qiáng)度與通過(guò)傳統(tǒng)重量法得到的脂質(zhì)含量存在一定的線性關(guān)系，從而建立了相關(guān)性較好的熒光分析方法。1998年，LEE等[19]研究了微藻Botryococcus brauniiUTEX 572，經(jīng)過(guò)一定方法處理后，建立了相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.997的尼羅紅熒光分析方法，這一成果為取代傳統(tǒng)重量分析測(cè)定微生物油脂含量奠定了基礎(chǔ)。

20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)除了微藻，如真菌和酵母細(xì)胞等微生物也具有生產(chǎn)微生物油脂能力。因此，利用熒光分析法測(cè)量真菌和酵母細(xì)胞類(lèi)微生物油脂含量得到研究人員的廣泛關(guān)注。2004年，KIMURA等[20]以油脂真菌（Mortierella isabellinaIFO-7884、Mortierella nanaIFO-8794、Mortierellaramannianavar.、angulisporaIFO-8187）和油脂酵母（Lipomyces starkeyiIFO-10381、Rhodosporidium toruloidesIFO-0559、Cryptococcus curvatusIFO-1159）為研究對(duì)象，考察了預(yù)處理方法（溫度處理、冷凍處理、電場(chǎng)處理等）和染色條件（染色時(shí)間、細(xì)胞濃度等）對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響規(guī)律，篩選出最優(yōu)操作條件，在最優(yōu)條件下，建立了適用于不同真菌和酵母細(xì)胞并具有較高相關(guān)系數(shù)的熒光分析方法，從而拓展了尼羅紅的熒光分析方法在微生物油脂測(cè)定中的應(yīng)用范圍。表2是目前以尼羅紅為染料應(yīng)用于測(cè)量不同微生物脂質(zhì)含量的熒光分析方法。由表2可得，對(duì)于大多數(shù)微生物，建立的熒光分析方法的相關(guān)系數(shù)大都超過(guò)0.8，尤其是Chlorella vulgaris[21]微藻，其線性相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.99，這可能是由于此類(lèi)微藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性比較好，染色劑比較容易進(jìn)入細(xì)胞。

表2 不同溶劑和不同微生物中尼羅紅熒光分析方法的線性關(guān)系比較Table 2 Compared with the correlation of Nile red fluorescenct method for different microbial in different solvent

1.3 尼羅紅熒光分析方法存在的問(wèn)題及解決方案

經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，尼羅紅熒光分析法的開(kāi)發(fā)和研究取得顯著的成績(jī)，解決了許多應(yīng)用難題，并被認(rèn)為是未來(lái)最具應(yīng)用前景的微生物油脂測(cè)定方法。但其實(shí)際應(yīng)用仍受溶劑、尼羅紅染色劑特異性以及細(xì)胞通透性等因素的影響。

1.3.1 溶劑

如1.1所述，溶劑對(duì)熒光分析結(jié)果影響很大。因此，對(duì)于不同的微生物細(xì)胞，溶劑的選擇對(duì)熒光分析法的可靠性尤為重要。由表2可知在尼羅紅熒光分析中，一般選用丙酮作為溶劑，這是由于尼羅紅較易溶于丙酮，且丙酮分子小、易揮發(fā)，有助于尼羅紅進(jìn)入細(xì)胞，特別是在沒(méi)有細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁、細(xì)胞膜較薄的微生物中應(yīng)用較多[27]，而對(duì)于那些細(xì)胞壁較厚的微生物一般使用滲透能力比較強(qiáng)的DMSO作為染色劑溶劑。CHEN等[23]在微藻Dunaliella tertiolecta的油脂含量測(cè)定中使用DMSO溶劑增加細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。然而，DMSO分子在細(xì)胞懸浮液中對(duì)細(xì)胞的完整性破壞要比丙酮大，當(dāng)DMSO的濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度會(huì)顯著降低，這是由于懸浮液中細(xì)胞碎片會(huì)顯著增多，使得染色劑無(wú)法與細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合。因此，在尼羅紅熒光分析法過(guò)程中，一般先確定細(xì)胞壁的厚度和細(xì)胞膜通透性，對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁比較薄的微生物，采用丙酮作為溶劑；而對(duì)擁有較厚細(xì)胞壁的微生物則采用DMSO作為染色劑溶劑。

1.3.2 尼羅紅染色劑的特異性

尼羅紅染色劑在細(xì)胞內(nèi)部這個(gè)疏水性的環(huán)境中，除了可以與脂質(zhì)液滴結(jié)合發(fā)出熒光之外，還有可能與疏水環(huán)境中的特定蛋白質(zhì)或其他疏水性物質(zhì)（例如葉綠素等非油脂成分）結(jié)合，同樣可以產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[28]；同時(shí)，某些微藻中含有較多色素，在一定的激發(fā)光照射下也會(huì)產(chǎn)生一定的熒光強(qiáng)度，使尼羅紅的熒光分析過(guò)程中細(xì)胞的背景熒光值增加，影響熒光分析方法的準(zhǔn)確性和靈敏性。

1.3.3 增強(qiáng)細(xì)胞通透性的措施

在尼羅紅熒光分析方法建立中，熒光淬滅和染色劑的滲透等問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了其進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)于熒光淬滅問(wèn)題，一般考慮尋找性能更加穩(wěn)定的染色劑或?qū)θ旧珓┻M(jìn)行改性；而對(duì)于染色劑滲透問(wèn)題，一般使用化學(xué)或物理方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，從而增加細(xì)胞通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。

（1）化學(xué)方法

化學(xué)方法主要是指使用一定百分比的有機(jī)試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理，其目的是增加細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞；同時(shí)，加入一定量的有機(jī)試劑可以增加溶液的疏水性，使染色劑更加穩(wěn)定。目前比較常見(jiàn)的有機(jī)試劑有DMSO、丙酮、乙醇、甘油及乙二胺四乙酸（EDTA）等[26,29]。

DMSO是一種常見(jiàn)的極性有機(jī)溶劑，其對(duì)細(xì)胞膜具有較強(qiáng)的親和性，使用一定百分比的DMSO溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮，不僅可以一定程度上增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞，而且可以改變懸浮液的極性，使染色劑在染色過(guò)程中淬滅速率減慢，更加有利于細(xì)胞染色。同時(shí)，DMSO屬于體積較小的極性分子，而細(xì)胞膜一般是由磷脂雙分子層組成的，具有流動(dòng)性，根據(jù)滲透原理，DMSO分子可以比較容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，染色劑分子可以隨著DMSO分子一起進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)染色的目的[30]。因此，在一些較厚細(xì)胞壁或者細(xì)胞通透性比較差的細(xì)胞中，使用一定百分比的DMSO對(duì)其進(jìn)行懸浮，可以在一定程度上增強(qiáng)染色劑的熒光強(qiáng)度，提高熒光分析方法的準(zhǔn)確性。

丙三醇（甘油），與 DMSO相比其細(xì)胞毒性比較小，與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層等成份相似，根據(jù)相似相溶原理，其可以比較容易滲透進(jìn)入細(xì)胞。PICK等[27]報(bào)道了使用不同百分比的甘油作為細(xì)胞懸浮液，發(fā)現(xiàn)甘油可以顯著增加細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其效果甚至比DMSO懸浮的效果好。但甘油與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，在染色過(guò)程中，染色劑可能會(huì)與甘油結(jié)合，導(dǎo)致熒光背景值增強(qiáng)，會(huì)降低熒光分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。

化學(xué)處理方法可以一定程度上增加細(xì)胞通透性，增強(qiáng)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，但也存在增強(qiáng)染色背景值、不利于細(xì)胞長(zhǎng)期保存等問(wèn)題。

（2）物理方法

物理處理方法一般是通過(guò)改變外界條件，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理來(lái)增加細(xì)胞的通透性，使染色劑更加容易進(jìn)入細(xì)胞。主要包括熱處理法、凍干法、微波法、電場(chǎng)法、超聲法等。

①熱處理法是在一定的溫度范圍內(nèi)（30～70℃）對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行水浴加熱處理，使得懸浮液中細(xì)胞的活性降低，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減緩，從而使染色劑與細(xì)胞的接觸時(shí)間更長(zhǎng)，更加容易進(jìn)入細(xì)胞，所得熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)[31]。但由于不同細(xì)胞的耐溫性不同，因此，對(duì)于不同的細(xì)胞，在保證細(xì)胞不失活的前提下，最大限度地加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞，選擇合適的溫度進(jìn)行處理對(duì)熒光分析方法的建立至關(guān)重要。

②冷凍干燥法，即先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍干，然后磨碎，測(cè)定其熒光強(qiáng)度的一種方法。由于測(cè)定過(guò)程中不存在細(xì)胞懸浮，可以在一定程度上減少環(huán)境中熒光產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)[21]，此外，也有人在液氮保護(hù)下進(jìn)行研磨，這種方法得到的微生物菌體，避免了在研磨過(guò)程中菌體結(jié)構(gòu)和內(nèi)部脂質(zhì)液滴的破環(huán)，對(duì)測(cè)定菌體粉末中的脂質(zhì)含量具有一定的意義。冷凍干燥處理主要應(yīng)用于一些需要長(zhǎng)期保存的細(xì)胞樣品中。

③微波處理方法。微波具有較強(qiáng)的穿透能力，可以改變細(xì)胞膜的孔通透性，從而加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。微波處理后，分子內(nèi)的熱運(yùn)動(dòng)加快，染色劑迅速進(jìn)入細(xì)胞，從而增加染色效果。但微波處理也很容易導(dǎo)致細(xì)胞被擊穿而失活，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性比較差等問(wèn)題[32]。

④電場(chǎng)處理。細(xì)胞在電場(chǎng)力的作用下會(huì)加速自我旋轉(zhuǎn)，增加細(xì)胞與染色劑的接觸機(jī)會(huì)；同時(shí)，在電場(chǎng)作用下，染色劑分子在溶液中的擴(kuò)散更快，更加容易進(jìn)入細(xì)胞[33]。

與化學(xué)方法相比，物理處理方法條件比較容易控制，相對(duì)比較穩(wěn)定，操作比較簡(jiǎn)單，同時(shí)，使用物理方法對(duì)環(huán)境的污染比較小，有利于可持續(xù)發(fā)展。但在使用物理方法處理細(xì)胞懸浮液時(shí)，也存在其處理強(qiáng)度難以控制，容易導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡等問(wèn)題。

2 BODIPY 505/515及其在微生物油脂測(cè)定中的應(yīng)用

2.1 BODIPY 505/515的結(jié)構(gòu)及其光學(xué)性質(zhì)

BODIPY 505/515結(jié)構(gòu)式與分子式分別如圖1和表1所示。與尼羅紅相比，BODIPY 505/515具有較高的熒光量子產(chǎn)率和較好的摩爾消光系數(shù)，同時(shí)，對(duì) pH和極性環(huán)境的變化不敏感，熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定，也具有相對(duì)較強(qiáng)的發(fā)射峰，在不同的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下，其熒光基團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA等具有一定的熒光最大值，通常應(yīng)用于細(xì)胞脂質(zhì)分析中。在熒光分析細(xì)胞脂質(zhì)中，BODIPY 505/515具有較強(qiáng)的特異性，一般不與細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)液滴結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)色素等物質(zhì)對(duì)其干擾也比較小，可用于細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)液滴可視化觀察（圖2）[28,34]。由圖2可以清楚地看出BODIPY 505/515熒光探針進(jìn)入微藻細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)結(jié)合，在一定的激發(fā)光照射下，產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，同時(shí)與尼羅紅染色劑相比，在可視化觀察細(xì)胞脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，綠色熒光更加明顯地分布在細(xì)胞的某些位置，說(shuō)明BODIPY 505/515染色劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)具有較強(qiáng)的選擇性。

圖2 不同微藻C.vulgaris和D. primolecta在尼羅紅和BODIPY染色下的熒光顯微照片：C. vulgaris微藻在BODIPY（a）和尼羅紅（b）染色劑染色； D. primolecta微藻在BODIPY（c）和尼羅紅（d）染色劑染色[5]Fig.2 Differential interference contrast (DIC) images of C.vulgaris, D. primolecta,respectively stained with BODIPY and Nile red: C. vulgaris stained with BODIPY (a) and Nile red (b);D. primolecta stained with BODIPY (c) and Nile red (d)

2.2 BODIPY 505/515熒光分析方法的發(fā)展和應(yīng)用

BODIPY 505/515分子量較小，化學(xué)結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)比尼羅紅穩(wěn)定，容易與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)相融合，對(duì)細(xì)胞的滲透能力較強(qiáng)，更容易進(jìn)入細(xì)胞。如表3所示，在微生物熒光分析方法中，BODIPY 505/515一般溶解在DMSO中，對(duì)不同的微生物細(xì)胞進(jìn)行熒光分析時(shí)，其激發(fā)波長(zhǎng)存在一定差異。BODIPY 505/515熒光染色劑雖然發(fā)展歷史不長(zhǎng)，但已有許多關(guān)于其在不同微生物中應(yīng)用的報(bào)道。2012年，GOVENDER等[28]和BRENNAN等[34]幾乎同時(shí)提出了BODIPY 505/515熒光染料在微生物油脂測(cè)定方面的應(yīng)用。GOVENDER以微藻ChlorellavulgarisCCAP 211/1113和Dunaliella primolecta11/34為研究對(duì)象，比較了尼羅紅和BODIPY 505/515染色劑對(duì)細(xì)胞的可視化觀察，發(fā)現(xiàn)BODIPY 505/515染色劑在細(xì)胞中的熒光更加穩(wěn)定，選擇性更強(qiáng)，可以更加清楚的觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴。隨后，BRENNAN等研究了Nanno chloropsis oculata等微藻，主要探究了不同溶劑對(duì)BODIPY 505/515熒光探針的染色效果，發(fā)現(xiàn)BODIOY 505/515在DMSO中的效果最好，該結(jié)果對(duì)后續(xù)的研究具有重要借鑒意義。2010年，COOPER等[35]研究一些較大體積的微藻，例如儲(chǔ)油微藻Ophiocytiummaius Naegeli Xanthophyceae、細(xì)長(zhǎng)的單細(xì)胞微藻Chrysochromulinasp. Haptophyceae、MallomonassplendensSynurophyceae等，發(fā)現(xiàn)BODIPY 505/515熒光探針可以輕易地滲透進(jìn)入各種不同微藻細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴結(jié)合，產(chǎn)生較穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，在熒光顯微鏡下，可以清楚地觀察到微藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴的分布。目前，BODIPY 505/515染色劑一般應(yīng)用于微藻細(xì)胞的研究，在酵母細(xì)胞、真菌等其他微生物中的研究還比較少，有待進(jìn)一步探究。

表3 BODIPY 505/515熒光探針的溶劑種類(lèi)和激發(fā)波長(zhǎng)Table 3 The solvent and excitation wavelength of fluorescence dye BODIPY505/515

2.3 BODIPY 505/515熒光分析方法存在問(wèn)題

與尼羅紅相比，BODIPY 505/515主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)等其他疏水性物質(zhì)的可視化觀察，在熒光分析方法建立方面應(yīng)用較少。這是由于BODIPY 505/515熒光染色劑在溶液中比較穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞后其熒光淬滅比較慢，可以比較方便地應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布的觀察，但其在溶液中的熒光背景值比較強(qiáng)，建立的熒光分析方法的靈敏性比較差。除此之外，BODIPY 505/515還存在染色劑滲透問(wèn)題、細(xì)胞內(nèi)熒光淬滅問(wèn)題、溶劑選擇問(wèn)題等。

（1）熒光背景問(wèn)題。隨著對(duì) BODIPY 505/515熒光探針研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)其溶解在有機(jī)溶劑中時(shí)，雖然可以較快速地進(jìn)入細(xì)胞、比較清晰地觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，但在熒光分析方法的線性建立過(guò)程中，細(xì)胞的脂質(zhì)含量與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系比較弱（低于尼羅紅染色劑的線性關(guān)系），主要原因是BODIPY 505/515熒光探針對(duì)溶劑的極性變化不敏感，導(dǎo)致在細(xì)胞懸浮液中其熒光背景值比較強(qiáng)[8]。

（2）滲透問(wèn)題。BODIPY 505/515的分子量比尼羅紅的分子量小（表1），分子結(jié)構(gòu)更加對(duì)稱（圖1），同時(shí)，其分子較高的油/水分配系數(shù)導(dǎo)致染色劑分子可以很輕松地通過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[34]。一些細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單的微藻細(xì)胞（例如Chrysochromulinasp、Mallomonas splendens[35]等）有較快的滲透性，在熒光顯微鏡中可以較清楚地看出染色劑進(jìn)入細(xì)胞。但在一些細(xì)胞壁較厚或細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的微藻Nannochloropsisoculata[34]觀察時(shí)，BODIPY 505/515則比較難進(jìn)入微藻細(xì)胞，同時(shí)滲透率也比較低，因此，采用相應(yīng)的方法提高細(xì)胞通透性是必要的。

（3）細(xì)胞染色過(guò)程中熒光強(qiáng)度衰退問(wèn)題。熒光衰退現(xiàn)象是熒光探針?lè)治龇椒ㄆ毡榇嬖诘膯?wèn)題。在染色的過(guò)程中，由于熒光染色劑分子在一定的激發(fā)光照射下，分子內(nèi)部發(fā)生相互作用，分子的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度衰退；同時(shí)，熒光探針與脂質(zhì)特異性結(jié)合，分子間發(fā)生一定的鍵反應(yīng)，生成相應(yīng)的聚集體，導(dǎo)致染色劑熒光強(qiáng)度衰退[27]。

（4）溶劑問(wèn)題。DMSO、丙酮等有機(jī)溶劑可以增大 BODIPY 505/515的熒光強(qiáng)度，但這些有機(jī)試劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的毒性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有機(jī)試劑的濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致測(cè)定細(xì)胞死亡[9]。因此，已有的研究中，一般選用低濃度的DMSO作為BODIPY 505/515的溶劑（表3）。

（5）培養(yǎng)液中其他成分的干擾。在分析樣品的預(yù)處理過(guò)程中，由于一些微生物如微藻等，其培養(yǎng)液中可能存在其他一些未知的生長(zhǎng)習(xí)性相似的微生物，在染色過(guò)程中，這些未知的微生物也可能會(huì)被一起染色，從而影響 BODIPY 505/515熒光探針的可視化觀察和熒光分析方法的準(zhǔn)確性。這是由于在可視化觀察中，所有染色的微生物都可以被觀察到，從而無(wú)法分辨目標(biāo)微生物，不利于其結(jié)果分析；同時(shí)，在熒光定量分析中，由于每次微藻液中的未知微生物的含量不確定，從而導(dǎo)致建立的熒光分析方法的準(zhǔn)確性降低。但微藻培養(yǎng)液中的其他有機(jī)物對(duì)熒光分析結(jié)果影響較小，這些有機(jī)物在水溶液中濃度比較低，熒光探針一般都是疏水性的，其在水溶液中會(huì)迅速發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，故不會(huì)與水溶液中的有機(jī)物結(jié)合產(chǎn)生熒光，因而對(duì)熒光分析結(jié)果影響較小[8]。

3 尼羅紅和 BODIPY 505/515熒光分析方法的比較

在目前的研究中，尼羅紅熒光分析方法主要應(yīng)用于細(xì)胞的中性脂質(zhì)的定性定量測(cè)定，其對(duì)磷脂、膽固醇等類(lèi)型的脂質(zhì)響應(yīng)值比較低，應(yīng)用較少[18]。尼羅紅探針的熒光分析方法研究已經(jīng)比較成熟，不少研究者建立了線性比較好的熒光分析方法應(yīng)用于不同種類(lèi)的微藻、酵母、真菌等微生物[22]；然而，BODIPY 505/515作為一種相對(duì)新型的熒光探針，由于其光學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定且具有一些與尼羅紅探針相似的性質(zhì)，有研究者嘗試用其來(lái)取代尼羅紅熒光探針進(jìn)行細(xì)胞脂質(zhì)的定性定量測(cè)定[28]。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞脂質(zhì)液滴的觀察方面，BODIPY 505/515具有穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光強(qiáng)度高、可視化效果比較好等優(yōu)勢(shì)，但在細(xì)胞脂質(zhì)含量定量測(cè)定的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其建立的熒光分析方法線性較差，不利于其對(duì)脂質(zhì)的定量分析[28]。隨后，有研究者采用流式細(xì)胞儀來(lái)減弱其熒光背景，增強(qiáng)其線性關(guān)系，對(duì)一些微藻類(lèi)細(xì)胞建立了一定線性關(guān)系的熒光分析方法，但也還有許多問(wèn)題有待解決，例如熒光探針與脂質(zhì)液滴結(jié)合的機(jī)理、BODIPY 505/515在溶液中熒光背景值較強(qiáng)的原因等[36]?？偟膩?lái)說(shuō)，BODIPY 505/515作為一種近年發(fā)展起來(lái)的新型熒光探針，比尼羅紅熒光探針的應(yīng)用范圍更加廣泛。

4 結(jié)論與展望

微生物油脂是一種極具發(fā)展前景的生物柴油原料，高效篩選高油脂含量菌株是實(shí)現(xiàn)微生物油脂能源化利用的關(guān)鍵。熒光分析方法可以解決目前微生物油脂含量測(cè)定方法效率低、周期長(zhǎng)、污染大等問(wèn)題。本文以典型的脂溶性熒光染料尼羅紅和BODIPY 505/515為例，介紹了熒光探針在微生物油脂測(cè)定中的應(yīng)用。對(duì)兩種熒光分析方法的準(zhǔn)確性、適用性進(jìn)行比較，并對(duì)其細(xì)胞前處理、染色條件的優(yōu)化和存在的一些問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)。

與傳統(tǒng)的油脂分析方法相比，熒光分析方法具有綠色、環(huán)保、高效等優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用中，還存在一些問(wèn)題，例如熒光探針在水溶液中的穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑使用等，這些問(wèn)題也是未來(lái)熒光探針的研究方向和重點(diǎn)。其中，采用一定的方法增加熒光探針在水溶液中的穩(wěn)定性是未來(lái)的一個(gè)重要研究方向。熒光探針尼羅紅和BODIPY 505/515染色劑由于其疏水性，一般很難在水溶液存在；同時(shí)，染色劑分子在水溶液中會(huì)迅速發(fā)生褪色反應(yīng)，然后失去其特有的光學(xué)特性，因此一般采用有機(jī)試劑作為溶劑，這不利于可持續(xù)發(fā)展。為了保證染色劑的光學(xué)性能，不少研究者考慮從染色劑結(jié)構(gòu)、吸附性能入手增大其水溶性。KURNIASIH等[37]以十二烷基磺酸鈉（SDS）等表面活性劑為溶劑，對(duì)尼羅紅染色劑進(jìn)行吸附改性，發(fā)現(xiàn)尼羅紅染色劑在表面活性劑溶液中有較強(qiáng)的溶解性，發(fā)現(xiàn)其具有較好的光學(xué)性質(zhì)性能。FELBECK等[38]采用CTAB表面活性劑對(duì)水滑石進(jìn)行改性后，增加其吸附性，然后對(duì)染色劑進(jìn)行吸附處理，可以增大染色劑的溶解性。因此，對(duì)于未來(lái)熒光分析方法的發(fā)展，一方面可以考慮對(duì)染色劑本身進(jìn)行相應(yīng)的改性，例如在染色劑分子上引入一些親水性的官能團(tuán)，在增大熒光探針?biāo)苄缘耐瑫r(shí)不改變其光學(xué)性質(zhì)，同時(shí)減少熒光淬滅；另一方面可以考慮尋找熒光探針更好的附載體，其不但可以負(fù)載染色劑，使染色劑能溶解在水溶液中，而且可以產(chǎn)生較強(qiáng)的、穩(wěn)定的熒光，這是未來(lái)一個(gè)重要的研究方向。