李明美 李安琪 黃娟 焦晟 鄧曉濤 李浩 宋焱

高分辨磁共振成像已經(jīng)成為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）斑塊定量分析的主要影像學(xué)方法。他汀類藥和阿司匹林均具有延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用。他汀藥物能夠減少斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞的聚集［1］，延緩、甚至逆轉(zhuǎn)早期硬化斑塊的發(fā)展［2,3］。阿司匹林通過抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)從而抑制斑塊的進(jìn)展［4］。但兩藥聯(lián)合應(yīng)用是否能夠強(qiáng)化這種作用，目前尚無動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)數(shù)據(jù)。本研究利用高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的方法建立兔腹主動(dòng)脈AS模型，探討瑞舒伐他汀、阿司匹林和兩藥聯(lián)合三種方案對動(dòng)脈AS斑塊的治療效果，并通過高分辨磁共振成像評估治療后斑塊的變化情況。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇健康雄性新西蘭兔160只［北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，2.2～2.5 kg，合 格證 號SCXK（京）2012-0004］，高膽固醇飼料（100 g/日）喂養(yǎng)1周，隨后行腹主動(dòng)脈內(nèi)膜球囊剝脫術(shù)。術(shù)后，將160只新西蘭兔隨機(jī)分為對照組（高脂喂養(yǎng)）、A組（高脂喂養(yǎng)+阿司匹林治療）、T組（高脂喂養(yǎng)+瑞舒伐他汀治療）和AT組（高脂喂養(yǎng)+阿司匹林+瑞舒伐他汀治療），每組40只。各組兔子隨機(jī)分為術(shù)后1周組、2周組、1個(gè)月組和2個(gè)月組，每組10只。各組動(dòng)物行腹主動(dòng)脈管壁MR檢查，MR檢查后立即處死動(dòng)物，尸檢采集腹主動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色和巨噬細(xì)胞免疫組化染色。

2.給藥劑量

A組阿司匹林50 mg每日一次，T組瑞舒伐他汀5 mg每日一次，AT組阿司匹林50 mg每日一次及瑞舒伐他汀5 mg每日一次。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物室進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)、喂藥，給藥時(shí)需防止藥物被吐出。

3.兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型建立

160只新西蘭兔高脂喂養(yǎng)1周后，行經(jīng)股動(dòng)脈穿刺腹主動(dòng)脈內(nèi)膜球囊剝脫術(shù)。步驟如下：經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，剪去右大腿內(nèi)側(cè)兔毛并脫毛處理，消毒、鋪巾后，2%利多卡因皮下注射行局部麻醉，沿右股動(dòng)脈走行切開皮膚，于肌肉間隙鈍性分離股動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，用10號穿刺針行股動(dòng)脈穿刺，經(jīng)穿刺針將導(dǎo)引導(dǎo)絲送至腹主動(dòng)脈，置入4F血管鞘，通過血管鞘支臂推注肝素生理鹽水防止凝血，經(jīng)血管鞘把直徑4 mm、長15 mm的球囊擴(kuò)張導(dǎo)管送入腹主動(dòng)脈，連接壓力泵，將球囊加壓并維持球囊內(nèi)壓力在8 atm，外拉球囊導(dǎo)管約20 cm（約至髂總動(dòng)脈水平），將壓力泵歸零。球囊再次送入原位置，如此反復(fù)3次，完成球囊對腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷。結(jié)扎右股動(dòng)脈近心端，術(shù)區(qū)涂撒青霉素鈉粉劑，逐層縫合。術(shù)后3 d內(nèi)肌肉注射青霉素鈉注射液預(yù)防感染。

4.兔腹主動(dòng)脈MR掃描

MR檢查在Philips Achieva 3.0T MR掃描儀上進(jìn)行，采用膝關(guān)節(jié)線圈。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（2.4～2.7 mg／kg）麻醉，將兔置人膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，左側(cè)臥位，足先進(jìn)。掃描序列包括3D TOF、T1WI、T2WI和增強(qiáng)T1WI。首先進(jìn)行二維時(shí)間飛躍（2D TOF）序列掃描作為定位像，以髂動(dòng)脈分叉作為掃描起始層面，掃描范圍為髂血管分叉上方共6 cm的腹主動(dòng)脈。增強(qiáng)掃描由高壓注射器從兔耳緣靜脈注射釓噴酸葡胺（北陸藥業(yè)），劑量為0.15 mmol/kg（1 ml/kg），注射流率為0.7 ml/s，延遲時(shí)間為5 min。

5.MR圖像分析

將MR圖像傳輸至VTS工作站（清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像中心提供），利用后處理軟件CASCADE（美國華盛頓大學(xué)血管成像中心），由具有多年CASCADE軟件應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師盲法對所有的影像資料進(jìn)行定量分析，手動(dòng)描繪出MR圖像中兔腹主動(dòng)脈管腔及管壁外緣輪廓（圖1），通過后處理軟件計(jì)算得到掃描范圍內(nèi)每一層面血管壁管壁面積值、管腔面積值。管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)（normalized wall index,NWI）=管壁面積/（管壁面積+管腔面積）。

6.組織學(xué)檢查

MR掃描后立即經(jīng)耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)兔，以髂動(dòng)脈分叉為參照點(diǎn)分離腹主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗干凈后，置于10%的甲醛溶液固定24 h。隨后進(jìn)行系列脫水、浸蠟和包埋處理。對血管進(jìn)行橫斷面切片，切片厚度為5μm，行HE染色和巨噬細(xì)胞RAM-11免疫組化染色。

使用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對免疫組化染色圖像進(jìn)行分析。積分光密度（integrating optical density，IOD）為測量標(biāo)本結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各個(gè)像素點(diǎn)光密度之和，可反映被測結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化，IOD與被染物質(zhì)的質(zhì)量成正比［5］，因此本研究中以IOD值的大小反映AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的相對含量。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 13.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量用Kolmogorov-Smirnov Z檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05示差異有顯著性。

圖1 兔腹主動(dòng)脈同一位置MR圖像（左側(cè)臥位，層數(shù)：12）a)T1WI;b)增強(qiáng)T1WI;c)T2WI，細(xì)箭：腹主動(dòng)脈，粗箭：下腔靜脈

結(jié) 果

160只實(shí)驗(yàn)兔中41只因麻醉意外或手術(shù)死亡，3只因厭食、腹瀉死亡，另有10只未能完成MR檢查。最終完成MR的有106只，完成組織學(xué)染色的有116只（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)兔最終分組和完成情況

1.腹主動(dòng)脈管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)（NWI）的變化

1周時(shí)，對照組、A組、T組和AT組MR圖像所測得管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)分別為0.450±0.025、0.386±0.024、0.384±0.023、0.374±0.026。A組、T組和AT組NWI均比對照組減少，分別減少了14.2%、14.7%、16.9%（P＜0.05）。2周時(shí)，對照組、A組、T組和AT組MR圖像所測得管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)分 別 為0.410±0.046、0.396±0.032、0.388±0.033、0.386±0.062，分別比對照組減少了3.4%、5.4%、5.9%（P＞0.05）。1個(gè)月時(shí)，對照組、A組、T組和AT組MR圖像所測得管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)分別為0.453±0.027、0.370±0.019、0.392±0.043、0.391±0.031，分別比對照組減少了18.3%、13.5%、13.7%（P＜0.05）。2個(gè)月時(shí)，對照組、A組、T組和AT組MR圖像所測得管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)分別為0.447±0.032、0.369±0.022、0.386±0.023、0.387±0.025，分別比對照組減少了17.4%、13.6%、13.4%（P＜0.05）。

2.腹主動(dòng)脈組織學(xué)的變化

（1）HE染色標(biāo)本觀察：正常腹主動(dòng)脈內(nèi)膜較薄，在腔面只見一層內(nèi)皮細(xì)胞核及一層紅色、呈波浪狀的內(nèi)彈性膜，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積，無泡沫細(xì)胞或斑塊形成。

對照組1周時(shí)腹主動(dòng)脈內(nèi)膜呈環(huán)形或偏心性輕度增厚，內(nèi)膜可見少量、散在分布的泡沫細(xì)胞；2周時(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，呈不均勻環(huán)形或偏心性增厚，內(nèi)膜可見單個(gè)或多個(gè)聚集存在的泡沫細(xì)胞、細(xì)胞外脂滴形成；1個(gè)月時(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜呈環(huán)形或偏心性顯著增厚，殘余管腔面積明顯變小，呈現(xiàn)以內(nèi)膜下層大量泡沫細(xì)胞聚集、脂滴沉著、膠原纖維增生排列紊亂為標(biāo)志的動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)，少數(shù)血管內(nèi)膜表面為纖維細(xì)胞層；2個(gè)月時(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚較1個(gè)月時(shí)輕度增加，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞聚集及脂滴沉積較1個(gè)月時(shí)明顯增多，內(nèi)膜表面纖維細(xì)胞層較1個(gè)月時(shí)明顯，部分血管內(nèi)膜表面可見大量泡沫細(xì)胞聚集。

A組、T組和AT組1周時(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚較對照組1周時(shí)減輕，部分內(nèi)膜未見增厚改變。A組、T組和AT組2周時(shí)可見內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞和細(xì)胞外脂滴沉積，上述變化較對照組2周時(shí)減輕。A組、T組和AT組1個(gè)月時(shí)內(nèi)膜增厚、內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞聚集、脂滴沉積及膠原纖維增生較其2周時(shí)進(jìn)展，較對照組1個(gè)月時(shí)減輕。2個(gè)月時(shí)A組、T組和AT組內(nèi)膜增厚程度與1個(gè)月時(shí)接近，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞數(shù)量及脂滴沉積較1個(gè)月時(shí)增多，上述變化較對照組2個(gè)月時(shí)減輕（圖2）。

（2）巨噬細(xì)胞免疫組化（RAM-11）染色結(jié)果：陽性染色表現(xiàn)為位于內(nèi)膜的棕黃色顆粒，以內(nèi)膜中下部分布為主，中膜及外膜亦可見少量陽性表達(dá)（圖3）。

2個(gè)月時(shí)，對照組、A組、T組、AT組巨噬細(xì)胞積分光密度（IOD）分別為（8.6±3.4）×104、（3.7±1.8）×104、（5.8±2.2）×104、（7.1±3.1）×104，A組、T組、AT組的巨噬細(xì)胞數(shù)量均比對照組減少，分別減少了57.4%、31.5%、17.4%。

圖3 對照組2個(gè)月巨噬細(xì)胞免疫組化（RAM-11）染色

討 論

高分辨磁共振血管壁成像可清楚顯示斑塊形態(tài)，并定性、定量分析斑塊成分［5,6］，對斑塊穩(wěn)定性做出評價(jià)。研究表明，MRI在體測量AS斑塊的形態(tài)學(xué)參數(shù)與組織病理學(xué)測量值高度相關(guān)［7,8］，表明高分辨MRI可準(zhǔn)確反映AS斑塊負(fù)荷。管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)對斑塊縱軸覆蓋長度和血管粗細(xì)不敏感［9］，且不受早期動(dòng)脈壁重塑機(jī)制的影響［10］，因此管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)是評估斑塊負(fù)荷的重要指標(biāo)，可直接反映AS病變的消長。

1.瑞舒伐他汀對斑塊的治療作用及MR評價(jià)

他汀類藥是臨床常用的降脂藥物。Makiko Yogo等［11］使用MRI檢測瑞舒伐他汀治療1年后AS的變化情況，發(fā)現(xiàn)降脂治療后動(dòng)脈管壁面積和管壁最大厚度均減少，提示瑞舒伐他汀長期治療能抑制AS斑塊負(fù)荷，逆轉(zhuǎn)AS斑塊的進(jìn)展。本研究利用瑞舒伐他汀治療兔腹主動(dòng)脈AS斑塊1周、2周、1個(gè)月及2個(gè) 月 時(shí)，進(jìn) 行MRI掃 描及組 織HE染色，發(fā)現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)均比對照組減少，HE染色內(nèi)膜增厚程度較對照組減輕，提示瑞舒伐他汀短期治療也能夠抑制斑塊進(jìn)展，高分辨MRI技術(shù)可以評估和監(jiān)測藥物的治療效果。研究提示他汀類藥物延緩AS之效能獨(dú)立于基線LDL-C水平之外［12,13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，阿托伐他汀可降低兔動(dòng)脈硬化模型內(nèi)膜及中膜單核細(xì)胞趨化蛋白水平，減弱巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞、核因子-kB活性，從而抑制炎癥反應(yīng)［14］。本研究中瑞舒伐他汀組在2個(gè)月時(shí)，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤較對照組明顯減少，與既往研究結(jié)果一致，提示瑞舒伐他汀具有抗炎作用，通過抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)減緩AS病變進(jìn)展。

2.阿司匹林對斑塊的治療作用及MR評價(jià)

阿司匹林是一種非甾體類抗炎藥。Paul等［15］研究發(fā)現(xiàn)使用阿司匹林治療高膽固醇飲食的載脂蛋白E基因缺陷小鼠10周后，主動(dòng)脈斑塊面積減少35%。唐熠達(dá)等［16］研究結(jié)果顯示應(yīng)用阿司匹林治療兔主動(dòng)脈AS斑塊12周后，斑塊面積及內(nèi)膜增生均減小，提示阿司匹林長期應(yīng)用能抑制AS斑塊進(jìn)展。本研究中阿司匹林組，在1周、2周、1個(gè)月及2個(gè)月時(shí)，動(dòng)脈管壁負(fù)荷均較對照組減少，HE染色動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度較對照組減輕，提示阿司匹林短期應(yīng)用亦能減緩AS斑塊發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程，高分辨MRI能夠?qū)Π邏K負(fù)荷的變化進(jìn)行評估和監(jiān)測。Cyrus等［17］、唐熠達(dá)等［16］發(fā)現(xiàn)阿司匹林能劑量依賴地顯著降低血清C-反應(yīng)蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白-1水平，二者是重要的炎癥標(biāo)志物，還直接參與AS斑塊的形成和進(jìn)展過程［18,19］。同時(shí)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞浸潤也顯著減少，提示阿司匹林抑制AS斑塊的作用與其抗炎作用有關(guān)，且阿司匹林的抗炎作用呈劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)中，阿司匹林50 mg/d（約等于臨床劑量440 mg/d［20］）2個(gè)月時(shí)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量比對照組顯著減少，提示阿司匹林可通過直接抑制炎癥細(xì)胞浸潤來抑制AS斑塊進(jìn)展，有利于粥樣斑塊的穩(wěn)定性，與既往的研究結(jié)果一致。

3.阿司匹林聯(lián)合瑞舒伐他汀對斑塊的治療作用及MR評價(jià)

在1周、2周、1個(gè)月及2個(gè)月時(shí)，AT組管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)比對照組顯著性減小，HE染色動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度較對照組減輕，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞及細(xì)胞外脂滴均較對照組減少，提示兩藥聯(lián)合使用能減緩AS斑塊進(jìn)展，抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定斑塊。

A組、T組、AT組對斑塊負(fù)荷的抑制效果比較如下：在1周、2周時(shí)，治療效果由強(qiáng)到弱依次是AT組、T組、A組；在1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)，治療效果由強(qiáng)到弱依次是A組、T組、AT組。2個(gè)月時(shí)，對斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤的抑制效果比較如下：由強(qiáng)到弱依次是A組、T組、AT組。這一結(jié)果提示在斑塊發(fā)生和發(fā)展的不同時(shí)期，三種治療方案對斑塊負(fù)荷、斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)的治療效果是不同的。此研究結(jié)果對臨床的指導(dǎo)意義有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

小 結(jié)

本研究通過高脂飲食聯(lián)合動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的方法建立兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型，使用阿司匹林、瑞舒伐他汀和兩藥聯(lián)合三種方案治療AS斑塊，通過高分辨MRI觀察斑塊負(fù)荷及斑塊形態(tài)學(xué)、斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)三種方案斑塊負(fù)荷均較對照組減小，斑塊內(nèi)膜增厚程度較對照組減輕，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量較對照組減少，證明在AS斑塊形成和發(fā)展過程中，阿司匹林、瑞舒伐他汀以及兩藥聯(lián)合均能抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，減緩AS疾病的進(jìn)展，黑血MR技術(shù)可用于對藥物療效的評估。