白潔 紀(jì)文靜 丁永年 彭媛媛 努爾麥麥提·葉爾遜

[摘要] 目的 探討miRNA-101及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1信號通路在肝纖維化中的作用。 方法 選取2013年1月～2018年1月新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)切除的20例肝纖維化組織作為研究組，選擇20例正常肝臟組織作為對照。采用免疫組化法分別檢測肝組織中TGF-β1、平滑肌α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測肝組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表達(dá)情況，分析TGF-β1、α-SMA及miRNA-101的相關(guān)性。 結(jié)果 肝纖維化組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常肝組織（P < 0.05），肝纖維化組織中α-SMA的mRNA表達(dá)水平與正常肝組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。TGF-β1和α-SMA在肝纖維化組織中的陽性表達(dá)隨肝纖維化程度的加重而增強(qiáng)，呈正相關(guān)（r = 0.53、0.57，均P < 0.05）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r = 0.633，P < 0.01）。肝纖維化組織miRNA-101水平低于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。miRNA-101與TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。 結(jié)論 miRNA-101下調(diào)可能通過調(diào)控TGF-β1而參與肝纖維化。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA-101;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;肝纖維化

[中圖分類號] R575.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0016-05

肝纖維化是幾乎所有慢性肝損傷所伴發(fā)的病理過程，肝纖維化最后可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭。有研究表明，肌成纖維細(xì)胞的活化參與肝纖維化發(fā)病機(jī)制[1]，其中肝星狀細(xì)胞（HSC）、門靜脈成纖維細(xì)胞和骨髓來源的膠原生成細(xì)胞是三大細(xì)胞群。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是一種重要的促增殖介質(zhì)，TGF-β1的過表達(dá)增加了膠原α1 mRNA和平滑肌α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的水平[2]，靶向TGF-β1可能是治療肝纖維化的一種有效方法。microRNAs（miRNAs）是內(nèi)源性的23 nts的RNAs，通過與蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA配對參與基因調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與促進(jìn)和抑制HSC活化[4]，調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)的miRNAs可能是調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)肝纖維化HSC活化的一種途徑[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-101a通過靶向c-Fos抑制心肌纖維化[6]。然而，目前關(guān)于miRNA-101靶向TGF-β1或與肝纖維化有關(guān)的報(bào)道較少。本研究對TGF-β1、miRNA-101在肝纖維化組織和正常肝組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，并分析兩組的相關(guān)性，希望為肝纖維化的預(yù)防治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2018年1月新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的20例原發(fā)性肝癌合并肝纖維化患者為研究對象，根據(jù)Ohkuma′s分級標(biāo)準(zhǔn)[7]將肝組織纖維化分為4級，其中Ⅰ級6例，Ⅱ級7例，Ⅲ級5例，Ⅳ級2例。另選擇20例因肝臟轉(zhuǎn)移癌行肝臟切除患者的肝臟正常組織作為對照。兩組年齡、性別、Child-Pugh肝功能分級等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性，見表1。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者及家屬均知曉本次診治方案，并簽字確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)及結(jié)果判定? 免疫組織化學(xué)染色方法采用SP法。TGF-β1和α-SMA單克隆抗體均購于北京中山生物技術(shù)有限公司，均為鼠抗人單克隆抗體。每組以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。其中TGF-β1和α-SMA以肝細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色、棕黃色或黃褐色顆粒為陽性，同時(shí)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野計(jì)算視野內(nèi)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取其平均數(shù)，并綜合染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行判定[5]，染色強(qiáng)度評分：“-”為不著色，“+”為黃色，“++”為棕黃色，“+++”為黃褐色。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表達(dá)? 樣本中加Trizol 5 mL反復(fù)吹打，室溫放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，依次加入氯仿、異丙醇，4℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，1 mL 75%乙醇（0.1%DEPC水臨時(shí)配制并冰?。┫礈霷NA沉淀，4℃ 8000 g離心5 min，棄上清，自然晾干，200 μL DEPC水溶解，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。使用Sigma公司TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。選擇SimpliAmp公司的熒光定量PCR儀，采用Abcam公司的TaqMan PCR試劑盒對miRNA-101進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，miRNA的相對表達(dá)水平為2-△Ct，△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參。miRNA-101上游引物為5′-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3′，下游引物為5′-TCTGGACAGTCTGCAGTTGG-3′;TGF-β1上游引物為5′-AGCCGTTTGGAGGGGCGGTT-3′，下游引物為5′-GCTGCATGGTCAGCAGGGCA-3′;α-SMA上游引物為5′-GCTGCCCAGAGACCCTGTT-3′，下游引物為5′-TTTGATGGATGCCAGCAGACT-3′;GAPDH上游引物為5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′。PCR反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10 μL，4種dNTP混合物各200 μmol/L，引物各100 μmol，模板DNA 0.1 μg，Taq DNA聚合酶2.5 μL，Mg2+ 1.5 mmol/L，加雙蒸水或三蒸水至100 μL。按三步法進(jìn)行DNA擴(kuò)增，95℃ 20 s，94℃ 25 s，55℃ 15 s，75℃ 10 s，40次循環(huán)條件：72℃ 10 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)及miRNA-101表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法，TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)與肝纖維化級別的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化組織及正常肝組織中TGF-β1和α-SMA的mRNA表達(dá)

肝纖維化組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)[（81.6±21.6）%]明顯高于正常肝組織[（68.3±20.4）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），肝纖維化組織中α-SMA的mRNA表達(dá)[（47.3±10.5）%]與正常肝組織[（41.1±11.3）%]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。TGF-β1和α-SMA在肝纖維化組織中的蛋白表達(dá)隨肝纖維化程度的加重而增強(qiáng)，呈正相關(guān)（r = 0.53，P < 0.05;r = 0.57，P < 0.05）。見表2、圖2（封四）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.633， P < 0.01）。見圖3。

2.2 肝纖維化組織及正常肝組織中miRNA-101的表達(dá)水平比較

肝纖維化組織miRNA-101水平[（0.72±0.12）×105]低于正常肝組織[（1.05±0.02）×105]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

2.3 肝纖維化組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)與miRNA-101相關(guān)性分析

肝纖維化組織中miRNA-101與TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

肝纖維化是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要環(huán)節(jié)，以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚為特征。miRNA是肝纖維化的重要調(diào)控因子，多種miRNA被證實(shí)參與了肝臟纖維化過程[8-11]。

miRNA能與目標(biāo)基因mRNAs的3′-非翻譯區(qū)域的多個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合，并負(fù)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)翻譯水平[12]。由于miRNA可以調(diào)節(jié)幾個(gè)功能相關(guān)的mRNA，且一個(gè)單一的基因可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控[12]，近年來miRNAs在肝纖維化中的作用是研究熱點(diǎn)之一[8]。最近，已經(jīng)報(bào)道了Let-7家族、miRNA-195、miRNA-99a、miRNA-130、miRNA-126、miRNA-230、miRNA-145和miRNA-199b在肝纖維化組織中特異性表達(dá)[8-11，13]。miRNA-101家族成員是從兩個(gè)基因組位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的高度保守的miRNAs。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-101在心肌纖維化中下調(diào)，進(jìn)一步的體內(nèi)研究表明miRNA-101通過靶向c-Fos抑制心臟纖維化[6]。目前關(guān)于miRNA-101與肝臟纖維化的關(guān)系及機(jī)制尚不清楚。TGF-β信號通路中的多個(gè)成分已經(jīng)被證實(shí)為miRNAs的靶點(diǎn)，因此，miRNAs可能參與調(diào)節(jié)TGF-β受體在HSC活化和肝纖維化形成過程中的表達(dá)。本研究關(guān)注了miRNA-101及TGF-β1在肝纖維化組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明TGF-β1在人肝纖維化組織中表達(dá)上調(diào)，與HSC活化有關(guān);miRNA-101在肝纖維化組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與有關(guān)研究結(jié)果基本一致[14-15]。

TGF-β1是肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。TGF-β1可以調(diào)控miRNAs的表達(dá)，但是miRNAs也可以影響TGF-β1信號通路蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)TGF-β1功能[16]。TGF-β1激活HSC細(xì)胞膜的TGF-β1/SMAD信號通路進(jìn)而活化HSC[18]。此外，TGF-β1可以使HSC發(fā)生快速的功能和形態(tài)學(xué)改變，并成為纖維母細(xì)胞，分泌膠原和α-SMA[19]。ECM組分的改變可進(jìn)一步刺激成纖維細(xì)胞和HSC活化，反過來使TGF-β1維持高水平[20]。α-SMA是TGF-β1信號傳導(dǎo)通路的激活信號蛋白，有促進(jìn)肝纖維化作用[17]。本研究中，TGF-β1蛋白在人肝纖維化組織中的表達(dá)明顯增高，肝纖維化組織中α-SMA的表達(dá)率較高，且隨著纖維化程度的增加，兩者表達(dá)也隨之增加。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TGF-β1與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)，提示TGF-β1可以活化HSCs，促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。

總之，本研究驗(yàn)證肝纖維化患者肝臟組織miRNA-101表達(dá)下調(diào)，并揭示miRNA-101可能通過調(diào)控TGF-β1參與肝纖維化，有望為肝纖維化的防治提供新的思路。但本研究缺乏miRNA-101低表達(dá)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。今后，我們將通過構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型，觀察miRNA-101表達(dá)變化，并觀察miRNA-101與TGF-β1通路的關(guān)系，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。

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