李夢達，左 寧，杜紅旭，靳海洋，賀德先，牛洪斌

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/國家小麥工程技術研究中心/小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

作為植物內(nèi)源激素之一，水楊酸(salicylic acid，SA)普遍存在于植物體內(nèi)，并在植物抗病、抗低溫、抗旱和抗鹽等過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。水楊酸防御反應是植物能持續(xù)抵抗脅迫的一種防御機制[4-5]，水楊酸結合蛋白(SA binding protein，SABP)與水楊酸活性位點具有高度的親和力，在激活植物系統(tǒng)獲得性抗性中起著至關重要的作用[6]。逆境脅迫下，SABP與水楊酸結合抑制過氧化氫酶活性，使細胞內(nèi)過氧化氫含量升高，過氧化氫則作為第二信使誘導植物體內(nèi)抗性基因的表達，從而產(chǎn)生一系列系統(tǒng)抗性反應[7]。研究發(fā)現(xiàn)，SABP2也有可能在SA的信號傳導中起作用[8-9]。SABP2具有較強的酯酶活性，能以水楊酸甲酯作為底物發(fā)生催化反應，還可以將甲基水楊酸催化成水楊酸，繼而誘導抗性防御反應[2,10-12]。

研究表明，轉入大豆GmSABP2基因的擬南芥植株的抗鹽和抗干旱能力得到顯著提升[4]。將本生煙草中的NbSABP2基因沉默后，會出現(xiàn)植株矮小、葉片向下塌陷等一系列不利于抵抗逆境脅迫的特征[5]。在番茄中，鹽脅迫可誘導LeSABP2基因大量表達[13]。國內(nèi)外關于植物SABP2的化學結構及其與SA作用的信號轉導途徑和作用機理的研究較多[8,14-16]，但主要集中在擬南芥和煙草等植物上，在小麥中研究較少。本研究以河南省小麥旱作地區(qū)種植范圍較廣、抗旱能力較強的小麥品種洛旱8號為材料，采用RT-PCR方法克隆得到小麥TaSABP2基因，對其進行生物信息學分析，并對其在小麥各組織及干旱和鹽脅迫下的表達量進行初步分析，以期為小麥抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植與處理

供試小麥品種洛旱8號由洛陽市農(nóng)林科學院提供。選取大小一致、籽粒飽滿的種子用2%次氯酸鈉消毒5 min，經(jīng)蒸餾水徹底沖洗后轉移至濕潤濾紙上并置于25 ℃黑暗條件下發(fā)芽1 d。將露白的種子播種于直徑為30 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)，土壤基質為砂質壤土與營養(yǎng)土1∶1混合，每缽播種30粒，移入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照強度350 μmol·m-2·s-1，光/暗周期為 12/12 h，晝夜溫度為25/18 ℃)，待長至兩葉一心期進行脅迫處理。包括：(1)葉面噴施濃度為500 μmol·L-1的脫落酸(ABA)溶液；(2)葉面噴施濃度為1.2 mg·L-1的油菜素內(nèi)酯(BR)溶液；(3)每盆澆 200 mL水后進行斷水處理；(4)澆灌濃度為150 mmol·L-1的NaCl溶液。對照為噴施或澆灌等量的蒸餾水。分別于激素處理后0、3、6、12、24、48、72和96 h和脅迫處理后0、1、2、3、4、5、6、7和8 d取倒二葉，液氮迅速冷凍后-80 ℃保存。同時，將未處理的幼苗轉移至大田環(huán)境中，正常生長至揚花期，分離同一株小麥的旗葉、根、莖、花藥、雌蕊和穎殼組織，液氮迅速冷凍后-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

樣品全部獲取后采用TRIZOL試劑(天根生化，北京)提取總RNA，測定OD260/280值，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，按照3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa，日本)使用說明合成cDNA第一鏈。

1.3 小麥 TaSABP2基因全長cDNA擴增

利用小麥轉錄組數(shù)據(jù)庫拼接獲得的小麥TaSABP2基因EST序列，結合NCBI數(shù)據(jù)庫拼接、設計特異引物對TaSABP2-F1和TaSABP2-R1(表1)，以合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。PCR使用Ex Taq酶(TaKaRa，日本)，PCR體系與程序參考說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為56 ℃，延伸時間為1 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶并連接、轉化至大腸桿菌DH5α，陽性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司進行測序。

1.4 小麥 TaSABP2基因的生物信息學分析

采用NCBI-ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開放閱讀框；利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行編碼蛋白的保守結構域分析；用ExPASy-ScanProsite(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)預測編碼蛋白的功能位點；用CBS-TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測和分析氨基酸序列導肽；用CBS-SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預測蛋白的信號肽；用CBS-TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測和分析基因編碼的氨基酸跨膜結構域；用Cell-Ploc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi//)預測蛋白亞細胞定位；用ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預測蛋白親疏水性；用CBS-NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析蛋白質序列潛在磷酸化位點；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析蛋白質的二級結構；用ExPASy-ProtParam Tool(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析蛋白質的各種理化性質；用DNAStar及在線軟件boxshade(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進行多重序列比對；用DNAStar軟件，采用Jotun Hein Method構建系統(tǒng)進化樹；用ExPASy-SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)程序預測蛋白質三級結構。

1.5 qRT-PCR分析

根據(jù)測序證實的TaSABP2基因cDNA序列設計特異性引物TaSABP2-F2和TaSABP2-R2，以Actin作內(nèi)參，設計引物ACT-F和ACT-R(表1)。參考上海生工的Green-2-Go qPCR Mastermix說明書進行Real-time PCR 擴增，3次生物學重復。采用2-△△Ct法[17]計算TaSABP2基因的相對表達量。

表1 基因克隆和實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used in gene cloning and real-time PCR

2 結果與分析

2.1 小麥 TaSABP2基因cDNA克隆與序列分析

以洛旱8號小麥葉片總RNA反轉錄來源cDNA第一鏈為模板，利用特異性引物TaSABP2-F1和TaSABP2-R1進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在800 bp左右出現(xiàn)一個特異條帶(圖1)，回收、克隆和測序發(fā)現(xiàn)該片段長度為878 bp。

序列分析顯示，TaSABP2基因cDNA全長878 bp，5′端非編碼區(qū)41 bp，3′端非編碼區(qū)30 bp，起始密碼子ATG位于第42～44位，終止密碼子TGA位于第846～848位，開放閱讀框為807 bp，編碼268個氨基酸，分子量約為29.6 kD，等電點5.91。利用BLAST程序在NCBI進行比較分析，結果表明該序列與其他植物來源的水楊酸結合蛋白基因核苷酸序列相似度介于82%～87%之間，其中與短柄草(XP_003567195)的水楊酸結合蛋白基因核苷酸序列相似性最高，為87%；推導編碼氨基酸序列與短柄草(XP_003567195)氨基酸序列相似性達80%，表明所獲得的cDNA片段為水楊酸結合蛋白基因。

2.2 小麥 TaSABP2基因生物信息學分析

2.2.1TaSABP2基因編碼蛋白理化性質分析

TaSABP2基因編碼蛋白的基本理化性質分析結果表明，該蛋白為C1338H2081N353O378S15，原子總數(shù)為4 165，理論半衰期30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為47.16，脂溶系數(shù)為89.51，親水系數(shù)為0.022，無分泌蛋白，具有親水性，為非跨膜蛋白，亞細胞定位于葉綠體。其氨基酸的組成為酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)33個、堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)26個。該蛋白中亮氨酸含量最高，為11.6%，天冬酰胺含量最少，為0.7%。

2.2.2TaSABP2基因編碼蛋白功能域分析

TaSABP2基因推導的氨基酸序列包含Abhydrolase及PLN02211兩個結構域(圖2)，屬于Abhydrolase超家族。Abhydrolase是一種α/β水解酶，含有蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、酯酶、環(huán)氧化物水解酶和脫鹵酶的功能多樣的超家族。催化裝置通常包括三個殘基(催化三聯(lián)體)：絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸和組氨酸，并且通常該機制涉及對羰基碳原子的親核攻擊。在該推導氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)一個絲氨酸殘基的脂肪酶活性位點，序列為VVLVGHSLGG，位于第83～92位。

2.2.3TaSABP2基因編碼蛋白磷酸化位點

磷酸化是新生蛋白質最普遍和最重要的蛋白翻譯后修飾方式。通常來說，多肽鏈中的氨基酸潛在磷酸化位點越多，發(fā)揮更多功能的可能性也就越大[18]。TaSABP2基因編碼蛋白磷酸化位點預測結果顯示，該蛋白中有12個絲氨酸、5個蘇氨酸和3個酪氨酸可能被磷酸化。推測TaSABP2基因可能經(jīng)過蛋白磷酸化修飾后具有在逆境脅迫下信號傳導的功能。

1：cDNA擴增產(chǎn)物；M：Marker 2000。

1:Amplified product from cDNA; M:Marker 2000.

圖1小麥TaSABP2基因全長cDNA序列擴增結果

Fig.1ElectrophoresisofamplifiedproductsofTaSABP2genefull-lengthcDNA

圖2 小麥 TaSABP2 編碼蛋白結構域及活性位點預測結果Fig.2 Domain and active sites prediction of TaSABP2 protein from wheat

2.2.4TaSABP2基因編碼蛋白高級結構分析

軟件預測顯示，TaSABP2的二級結構由四種形式構成(圖3左)，包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸鏈、4.48%的β轉角、38.81%的無規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋為該蛋白二級結構中最主要的結構元件，α-螺旋、β轉角和延伸鏈分散于整個蛋白質中，且N-末端以無規(guī)則卷曲形式存在，C-末端以延伸鏈形式存在。

用SWISS-MODEL對TaSABP2進行三維建模，結果顯示該蛋白三級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要結構元件，β轉角和延伸鏈較少(圖3右)。結果以1y7h.1.B序列(煙草NbSABP2基因[2])為模板，相似度達53.97%，說明該蛋白結構與煙草SABP2水楊酸甲酯酯酶相似。

2.2.5 小麥TaSABP2基因與其他植物序列比對和樹化分析

利用DNAstar及在線boxshade軟件，將TaSABP2基因預測的氨基酸序列與來自短柄草、水稻、玉米、花生、谷子、煙草、馬鈴薯、芝麻和油棕的氨基酸序列進行比對分析，結果(圖4)表明，小麥 TaSABP2蛋白的氨基酸序列與水楊酸結合蛋白高度相似，與短柄草(GenBank登錄號XP_003567195)相似性最高，達81.7%。與玉米(GenBank登錄號XP_008674949)、谷子(GenBank登錄號XP_004970219)、玉米(GenBank登錄號XP_008657158)、水稻(GenBank登錄號XP_006644824)、油棕(GenBank登錄號XP_010908450)、煙草(GenBank登錄號NP_001312442)、花生(GenBank登錄號XP_015968631)、芝麻(GenBank登錄號XP_011099228)和馬鈴薯(GenBank登錄號XP_006363634)的相似性依次為73.7%、73.4%、72.1%、71.1%、57.6%、51.9%、50.0%、50.0%和50.0%。

氨基酸序列聚類分析結果(圖5)同樣顯示，TaSABP2與與短柄草(GenBank登錄號XP_003567195)親緣關系最近，并與玉米(GenBank登錄號XP_008657158、XP_008674949)、谷子(GenBank登錄號XP_004970219)和水稻(GenBank登錄號XP_006644824)等單子葉植物聚為一族，而與油棕(GenBank登錄號XP_010908450)等雙子葉植物關系較遠，表明TaSABP2的分化處于單雙子葉分化早期階段。

圖3 小麥 TaSABP2編碼蛋白的二級結構(左)和三級結構(右)Fig.3 Secondary structure(left) tertiary structure(right) of protein encoded by TaSABP2

圖4 不同物種SABP2預測氨基酸序列同源性比較Fig.4 Full amino acid sequence alignment of TaSABP2 from different species

2.3 小麥 TaSABP2基因組織特異性表達分析

以洛旱8號的葉片、花藥、雌蕊、穎殼、根和莖組織來源總RNA進行熒光定量PCR，結果顯示TaSABP2在小麥各組織中均有表達，但表達量存在差異，在花藥中表達量最高，莖中最低(圖6)。TaSABP2在花藥中的表達量分別是雌蕊、穎殼、根、葉和莖組織表達量的3.96、16.11、23.92、41.26 和56.49倍，顯示出較強的組織特異性。

2.4 小麥 TaSABP2基因對激素及非生物脅迫的應答分析

2.4.1 ABA和BR對TaSABP2基因表達的影響

TaSABP2轉錄表達總體上是受ABA和BR誘導上調(diào)表達的(圖7)，96 h內(nèi)均出現(xiàn)兩次峰值。葉面噴施ABA后3 h，TaSABP2的表達量出現(xiàn)第一次峰值，為對照的1.5倍，之后恢復正常水平，在處理后24～72 h，TaSABP2基因表達量又迅速上升，并且在處理后72 h達到最大值，為對照的4.32倍，之后其表達量呈下降趨勢。葉面噴施BR后3 h，TaSABP2的表達量出現(xiàn)第一次峰值，為對照的4.29倍，處理后在3～12 h表達量有所下降，但仍保持上調(diào)狀態(tài)，在處理后24 h有第二次明顯上調(diào)，僅次于處理后3 h，處理后24～96 h，其表達量又呈下降趨勢。

圖5 不同物種 SABP2基因的cDNA序列聚類分析Fig.5 Analogy analysis of cDNA sequences of SABP2 genes in different species

圖柱上不同字母表示不同組織間的差異達顯著水平(P<0.05)。

Different letters above the columns indicate significant differences among organs at 0.05 level.

圖6TaSABP2在不同組織中的相對表達量

Fig.6ExpressionofTaSABP2genesindifferentorgansofwheat

不同小寫字母表示ABA不同處理時間之間表達量差異達顯著水平(P<0.05)；不同大寫字母表示BR不同處理時間之間差異達顯著水平(P<0.05)。

Different small letters indicate significant differences among ABA treatment time at 0.05 level. Different capital letters indicate significant differences among BR treatment time at 0.05 level.

圖7外源ABA與BR對TaSABP2基因表達的影響

Fig.7EffectofexogenousABAandBRontheexpressionofTaSABP2gene

2.4.2 干旱與鹽脅迫處理對TaSABP2基因表達的影響

TaSABP2基因轉錄表達受干旱脅迫和鹽脅迫誘導上調(diào)，且均在脅迫第2天出現(xiàn)表達量高峰(圖8)。干旱脅迫第2天時TaSABP2基因表達量為對照的5.44倍，之后有所下降，在斷水后5 d降至最低值，但其表達量仍為對照的1.12倍，之后 雖有少量回升但變化不大。鹽脅迫處理2 d，TaSABP2基因表達量有大幅的上升，達到最大值，為對照的6.93倍。鹽脅迫后3 d，表達量迅速下降，但仍顯著高于對照；處理后3～8 d，其表達量曲折下降。

曲線上的不同小寫字母表示不同干旱脅迫時間表達量差異達顯著水平(P<0.05)，不同大寫字母表示不同鹽脅迫時間差異達顯著水平(P<0.05)。

Different small letters indicate significant differences among drought stress time at 0.05 level. Different capital letters indicate significant differences among salt stress time at 0.05 level.

圖8干旱與鹽脅迫處理對TaSABP2基因表達量的影響

Fig.8EffectofdroughtandsaltstressontheexpressionofTaSABP2gene

3 討 論

目前SABP2基因已經(jīng)在煙草、大豆、丹參等植物中被克隆[4-6,13]。從煙草、大豆和丹參中克隆的SABP2基因的開放閱讀框序列長度分別為804、786和780 bp，這與本研究克隆出的小麥SABP2基因cDNA長度(807 bp)高度一致。其中，賈亞軍等[4]發(fā)現(xiàn)大豆SABP2屬于α/β水解酶家族，具有絲氨酸-81、組氨酸-238和天冬氨酸-210三個催化分子。董慧霞[19]和李秀紅[6]等在楊樹和丹參水楊酸結合蛋白基因研究中也得出了相同結論。本研究在對小麥TaSABP2進行序列分析時發(fā)現(xiàn)，TaSABP2基因包含Abhydrolase及PLN02211兩個結構域及酶活性中心序列(VVLVGHSLGG)，屬于Abhydrolase超家族。這與其他植物上的研究結果較為一致，說明TaSABP2基因具有較為保守的結構域。在本研究中，序列比對結果表明TaSABP2基因核苷酸序列及其氨基酸序列與短柄草核苷酸及其氨基酸序列的相似性最高。系統(tǒng)進化樹分析表明TaSABP2基因和單子葉植物短柄草水楊酸結合蛋白的親緣關系最近，與油棕等雙子葉植物關系較遠，推測TaSABP2基因的分化處于單雙子葉分化早期階段。李秀紅等[6]發(fā)現(xiàn)，SA能夠誘導SABP2基因的大量表達；而在番茄中，鹽脅迫處理同樣可使LeSABP2基因大量表達[13]。賈亞軍等[4]認為，大豆水楊酸結合蛋白基因的表達受干旱和鹽的誘導，對提高擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性有重要作用。本研究通過對小麥植株進行ABA、BR、干旱和鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)均能誘導小麥TaSABP2基因表達量上調(diào)，說明該基因對外界逆境脅迫產(chǎn)生積極響應，推測其在小麥的抗逆過程中起著重要作用。前人研究中檢測到擬南芥蓮座葉中有SABP2基因轉錄，而在莖生葉中則無，認為擬南芥SABP2基因在體轉錄具有組織特異性[11]。本研究采用實時熒光定量PCR分析TaSABP2基因在小麥不同組織部位的表達模式，結果表明，該基因在根、莖、葉、花藥、雌蕊、穎殼中均有表達，但其表達量明顯不同，這說明TaSABP2基因可能在小麥的各個組織中均能發(fā)揮一定的作用，但其表達也具有明顯的組織特異性。