董先紅，程惠芬

(安吉縣第三人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 安吉 313300)

念珠菌感染性陰道炎為育齡婦女常見陰道黏膜真菌感染性疾病，主要表現(xiàn)為外陰瘙癢、分泌物增多、呈豆腐渣樣或凝乳狀，可引起宮頸炎、流產(chǎn)甚至不孕[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示[2]，近年來隨著抗菌藥物的普遍使用，耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，女性念珠菌感染性陰道炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前證實，感染途徑、性傳播途徑等為引起女性發(fā)生念珠菌感染性陰道炎的主要原因[3]；除此之外，陰道局部免疫狀態(tài)的失衡在念珠菌感染的過程中也發(fā)揮重要作用[4]。本研究分析念珠菌感染性陰道炎的菌種分布與耐藥性，以期為臨床診治提供參考，同時探討Th1/Th2平衡狀態(tài)在陰道局部免疫功能中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源 2015年1月—2017年1月本院婦產(chǎn)科門診擬確診為念珠菌感染(外陰陰道假絲酵母菌病vulvovaginal candidiasis，VVC)的456例女性患者的陰道分泌物真菌培養(yǎng)標本456份，入組標準：年齡18～50歲；主訴外陰瘙癢和/或燒灼、干燥等刺激癥狀；查體可見外陰腫脹、紅斑、豆渣樣分泌物增多；生理鹽水濕片鏡檢念珠菌培養(yǎng)陽性(油鏡下觀察見芽生孢子及假菌絲)， 符合霉菌性陰道炎的臨床診斷標準；排除2個月內(nèi)口服或外用過抗真菌類藥物的患者及妊娠或哺乳期患者?；颊吣挲g18～50歲，平均45.5±4.6歲；病程3天～3年，平均4.5±0.5個月。本研究經(jīng)我院倫理委員會同意。

1.2 培養(yǎng)鑒定 使用無菌試紙取患者陰道后穹窿分泌物，立即送檢，鏡檢見到假菌絲后接種于沙保弱培養(yǎng)基(Sabouraud’s medium)中(法國梅里埃公司生產(chǎn))，37 ℃溫度下培養(yǎng)48 h，將酵母樣真菌(購于衛(wèi)生部臨檢中心)轉(zhuǎn)種于科馬嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基中(購于廣州迪景微生物科技有限公司)；37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。根據(jù)菌落顯色不同，參照產(chǎn)品說明書鑒定念珠菌菌種(綠色或翠綠色的白色念珠菌，藍色為熱帶念珠菌，粉色為克柔念珠菌)；不能鑒別菌種的使用API-20 C AUX鑒定試劑盒(購于珠海迪爾生物工程有限公司)進行鑒定。使用珠海迪爾生物工程公司生產(chǎn)的迪爾真菌板進行藥敏試驗。

1.3 陰道分泌物中Th1/Th2型細胞因子水平檢測 在分離培養(yǎng)念珠菌為陽性的標本中隨機選擇100例設(shè)為觀察組，另選取同期來本院體檢的健康女性100名為對照組。各組受試者經(jīng)陰道后穹窿分泌物取出后置于含蛋白酶抑制劑的PBS液中，充分混合，2000 r/min離心采集上清液500 μL，送迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各樣本中干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、白介素-4(IL-4)水平，并計算IFN-γ/IL-4值。

2 結(jié)果

2.1 念珠菌構(gòu)成及分布特點 456例陰道分泌物真菌培養(yǎng)標本中，共分離培養(yǎng)出念珠菌278株，念珠菌檢出陽性率為60.96%(278/456)。主要檢出念珠菌(Candida)種類包括：白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、熱帶念珠菌(Candidatropical)、克柔念珠菌(Candidakrusei)等，其中白色念珠菌檢出率最高(77.7%)。

2.2 念珠菌藥敏試驗結(jié)果 念珠菌對常用幾種抗真菌藥物均具有較好的敏感性，對兩性霉素B、制霉菌素的敏感性最高(100%)。其中白色念珠菌對各抗真菌藥物的敏感性均最高。見表1。

表1 陰道分泌物檢出念珠菌的藥敏試驗結(jié)果(%)

注：R耐藥；I中敏；S敏感

2.3 Th1/Th2型細胞因子水平比較 選取的100例念珠菌為陽性患者年齡22～50歲，平均44.3±4.6歲；選取的100名同期健康女性年齡20～50歲，平均45.7±5.0歲；兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組陰道分泌物中IFN-γ、IL-12、IL-4水平均明顯高于對照組，IFN-γ/IL-4比值明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 陰道分泌物中Th1/Th2型細胞因子水平比較

3 討論

念珠菌可存在于正常人體的皮膚、黏膜或消化道中，屬于正常菌群之一，據(jù)統(tǒng)計，臨床上10%的健康婦女并未出現(xiàn)感染性陰道炎的癥狀尚可在陰道分泌物中培養(yǎng)出念珠菌[5]。當機體免疫力降低，或陰道局部內(nèi)環(huán)境發(fā)生某種改變時，也可發(fā)生念珠菌感染性陰道炎，因此念珠菌又屬于條件致病菌[6]。本研究中，念珠菌檢出結(jié)果為陽性的278例陰道分泌物標本中，白色念珠菌檢出率最高，為77.7%。提示臨床上念珠菌性陰道炎的感染病原菌仍然以白色念珠菌為主。

由于不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性存在差異，念珠菌對不同藥物的敏感性差異也較為明顯，對于存在劑量依賴性的藥物來說，治療過程中往往需要適當增加劑量[7]。本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，臨床常用的幾種抗真菌藥物對念珠菌的敏感性均較高，其中兩性霉素B對各種類型念珠菌的敏感性均為100%。對于白色念珠菌，除兩性霉素B以外，5-氟胞嘧啶、伏立康唑的敏感性均達到了90%以上，伊曲康唑、氟康唑的敏感性也高達85%以上?？梢姡咨钪榫鷮ι鲜鰩追N臨床常見的抗菌藥物的敏感性均較高。光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等對納入研究的幾種抗菌藥物的敏感性則存在菌種差異，且敏感性相對較低。

念珠菌作為陰道內(nèi)的正常寄居菌群，在維持陰道內(nèi)環(huán)境自凈及菌群平衡的過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。目前，對于機體感染念珠菌后的自身防御機制尚不完全清楚，已經(jīng)得到證實的是，當宿主發(fā)生免疫功能低下，或局部免疫功能紊亂時，可發(fā)生念珠菌感染性陰道炎[10]。輔助性T細胞(簡稱Th細胞，helper T cell)在機體抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用，主要有Th1細胞與Th2細胞兩種，其中，Th1細胞主要分泌白細胞介素(interleukin，IL)-12，干擾素(interferon，IFN)-γ，IFN-a，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-β等，主要參與細胞免疫和遲發(fā)性超敏性炎癥反應(yīng)；Th2可輔助B細胞分化為抗體分泌細胞，主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等，參與體液免疫應(yīng)答。機體正常時，Th1和Th2細胞功能處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能；當機體受到異己抗原攻擊時，Th1和Th2細胞中某一亞群功能升高，另一亞群功能降低，該現(xiàn)象即為Th1/Th2漂移。Th1/Th2失衡是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，參與了多種疾病的病理生理過程。IFN-γ、IL-12等可促使Th細胞由Th0向Th1分化，可增強吞噬細胞介導(dǎo)的抗感染機制，發(fā)揮抵御感染的作用，特別是細胞內(nèi)寄生菌的感染；IL-4、IL-10等細胞因子則可促使Th細胞由Th0向Th2分化，增加機體對病原體的易感性[11-12]。

IFN-γ是Th1細胞的標志，可增強機體抗感染機制；IL-12作為誘導(dǎo)Th1細胞分化的重要細胞因子，在人體內(nèi)可通過促進B細胞產(chǎn)生IgG發(fā)揮持續(xù)抗感染的作用[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，念珠菌感染性陰道炎患者的陰道分泌物中IFN-γ、IL-12水平明顯高于健康女性，表明發(fā)病早期以Th1介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)為主。IL-4作為Th2型細胞因子，主要由T細胞產(chǎn)生，對巨噬細胞、中性粒細胞的吞噬和殺傷病原體的能力有一定的抑制作用[14-15]。本研究中，念珠菌感染性陰道炎患者與正常受試者比較，存在陰道分泌物中IL-4水平明顯增高的現(xiàn)象，說明Th2出現(xiàn)了極化狀態(tài)。進一步分析Th1/Th2的平衡狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，念珠菌感染性陰道炎患者IFN-γ/IL-4比值明顯低于健康人群，即Th2型細胞因子對免疫功能的抑制作用大于Th1型細胞免疫功能的發(fā)揮。分析Th1/Th2失衡導(dǎo)致局部免疫功能的紊亂可能減低了機體對念珠菌的抵抗能力。

綜上所述，念珠菌感染性陰道炎以白色念珠菌為主，不同的念珠菌菌種對于抗菌藥物存在不同的耐藥性及敏感性。臨床應(yīng)根據(jù)菌種鑒定結(jié)果合理使用抗菌藥物。念珠菌感染性陰道炎患者存在局部免疫功能紊亂現(xiàn)象，如何糾正Th細胞分化失衡對念珠菌感染性陰道炎的有效治療具有重要意義。