閆 琦，王憲舉，魏海燕，呂世奇，張嬌嬌，丁路明

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 /蘭州大學(xué)旱區(qū)農(nóng)業(yè)與生態(tài)修復(fù)教育部工程研究中心，甘肅 蘭州 730020）

菊芋(Helianthus tuberosus)又名洋姜、鬼子姜，具有耐寒抗旱、耐貧瘠、耐病、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種能利用多年的粗放型植物，目前已在我國(guó)大部分地區(qū)廣泛種植[1-3]。因其地上莖葉豐富、產(chǎn)量高、適口性好且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，被用作一種優(yōu)質(zhì)的粗飼料[4]。傳統(tǒng)的利用方式以晾制干草為主，但在晾曬過(guò)程中使菊芋莖葉中粗蛋白含量、適口性和消化率下降，降低了飼料的利用率[5]，而且收割和晾曬受天氣條件限制。青貯是貯藏青綠飼料，保存其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的良好方法。青貯可以解決其在調(diào)制干草過(guò)程中葉片脫落和雨淋造成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失，并且青貯飼料柔軟多汁、氣味芳香、適口性好、可長(zhǎng)期保存，一年四季均可供應(yīng)，是解決牛、羊全年所需青飼料的有效途徑[6]，對(duì)發(fā)展菊芋產(chǎn)業(yè)和草地畜牧業(yè)有著重要的意義。

關(guān)于青貯，近年來(lái)的研究主要集中在提高青貯發(fā)酵品質(zhì)的添加劑，如微生物制劑、酶制劑、有機(jī)酸、糖類(lèi)等，其中以乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)為主的微生物制劑因其能有效提高青貯發(fā)酵性能而備受矚目[7-8]。張相倫等[9]研究表明，全株玉米(Zea mays)青貯中添加乳酸菌能有效降低霉菌含量、氨態(tài)氮含量，提高粗蛋白含量，從而提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。薛艷林等[1]對(duì)菊芋青貯添加生物制劑研究表明，添加乳酸菌可改善青貯品質(zhì)，而添加纖維素酶對(duì)發(fā)酵品質(zhì)沒(méi)有改善效果。目前，關(guān)于乳酸菌添加劑對(duì)菊芋青貯品質(zhì)的研究較少，而且對(duì)于不同生育期的菊芋來(lái)說(shuō)，添加乳酸菌對(duì)其青貯品質(zhì)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以蘭州大學(xué)榆中校區(qū)植物種質(zhì)資源圃種植的菊芋為研究對(duì)象，分別在不同時(shí)期收割后添加乳酸菌調(diào)制青貯飼料，探討乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋青貯品質(zhì)的影響，為菊芋青貯飼料加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為蘭州大學(xué)榆中校區(qū)植物種質(zhì)資源圃 (35°56′ N，104°09′ E，海拔 1 700 m)種植的菊芋，品種為L(zhǎng)ZJ119。在菊芋不同生育期(孕蕾前期、開(kāi)花期)刈割后，帶至實(shí)驗(yàn)室，切碎1～2 cm后，陰干，待其含水量下降到65%左右后進(jìn)行青貯[10]。青貯原料化學(xué)成分如表1所列。

表1 菊芋莖葉原樣的化學(xué)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Chemical compositions of Jerusalem artichoke stems and leaves (DM basis)

乳酸菌添加劑購(gòu)自臺(tái)灣亞芯生物技術(shù)有限公司，主要成分為植物乳桿菌LP70(Lactobacillus plantarum LP70)1 × 109cfu·g-1，總?cè)樗峋鷶?shù) 1.0 × 1011cfu·g-1。

1.2 青貯調(diào)制

試驗(yàn)于2017年7-10月進(jìn)行。采用雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中一個(gè)因素是菊芋的生育期，分別為孕蕾前期和開(kāi)花期；另一個(gè)因素是添加乳酸菌，分別為不添加 (CK)和添加 5 × 106cfu·g-1LAB，共4個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。將切碎至1～2 cm不同生育期的菊芋原料與添加劑混合均勻后，裝入 30 cm × 23 cm 聚乙烯青貯袋中，每袋約填裝 330 g，之后用真空包裝機(jī)抽真空封口，置于常溫避光條件下貯藏發(fā)酵，于60 d后，開(kāi)封混勻青貯飼料，取樣分析發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分[3]。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 感官測(cè)定

按照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)(DLG)青貯評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及等級(jí)評(píng)定方法，從色澤、氣味、質(zhì)地等方面對(duì)試驗(yàn)后菊芋青貯進(jìn)行綜 合評(píng)定[3, 11]。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)分析

取20 g青貯鮮樣，加入180 mL去離子水，用榨汁機(jī)攪碎1 min，然后用4層紗布過(guò)濾，得到青貯飼料濾液，-20 ℃保存待測(cè)，用于測(cè)定pH、乳酸 (lactic acid，LA)、乙酸 (acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid， PA)、 丁 酸 (butyric acid， BA)含量。pH用雷磁PHS-29A型pH計(jì)測(cè)定；濾液3 500 r·min-1離心 15 min，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜儀(SHI-MADZE-10A)分析濾液中LA、AA、PA、BA含量，色譜柱為ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column 300 mm × 8 mm，流動(dòng)相為 3 mmol·L-1高氯酸，流速為 1 mL·min-1，進(jìn)樣量為 5 μL，柱溫 50 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm[1, 10]。

1.3.3 營(yíng)養(yǎng)成分分析

營(yíng)養(yǎng)成分分析參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[12]，取新鮮青貯料65 ℃烘干至恒重，測(cè)得初水分，再將樣品粉碎，取粉碎樣在105 ℃下烘干后測(cè)定干物質(zhì) (dry matter, DM)含量；粗蛋白(crude protein, CP)含量使用凱氏定氮儀 (JK-9830，中國(guó))測(cè)定；粗灰分 (crude ash, Ash)用 550 ℃ 高溫灼燒法測(cè)定；中性洗滌纖維 (neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維 (acid detergent fiber，ADF)使用纖維分析儀(ANKOM -2000i，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定；總單寧(Tannin)的測(cè)定利用Folin-Ciocalteu法，凍干鮮樣測(cè)定；可溶性糖 (water soluble carbohydrates,WSC)含量使用分光光度計(jì)蒽酮-硫酸法進(jìn)行比色測(cè)定；氨態(tài)氮(ammonia-nitrogen, NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定。青貯原樣營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)試方法與青貯樣相同。

1.3.4 體外干物質(zhì)消化率測(cè)定

用ANKOM DAISY II體外模擬培養(yǎng)箱測(cè)定飼料體外干物質(zhì)消化率 (in vitro dry matter digestibility，IVDMD)[13-14]。首先配制緩沖液A和B(A：KH2PO410 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1， NaCl 0.5 g·L-1,CaCl2·2H2O 0.1 g·L-1，尿素 0.5 g·L-1；B: Na2CO315 g·L-1，Na2S·9H2O 1 g·L-1)，將緩沖液 A 和 B 進(jìn)行預(yù)熱(39 ℃)，之后先向消化瓶中加入緩沖液A 1 330 mL，然后向其中加 266 mL 緩沖液 B(比例為1∶5)，混合液pH調(diào)制6.8。于屠宰場(chǎng)進(jìn)行牦牛瘤胃液采集，將采集瘤胃液混合，每個(gè)消化瓶中加400 mL，之后將提前分裝在 F57濾袋的 500 mg待測(cè)樣品放入消化瓶，每個(gè)消化瓶加25個(gè)左右，平衡分布在消化瓶?jī)蓚?cè)，同時(shí)至少包括一個(gè)空白濾袋，然后向消化瓶中通CO2氣體30 s，蓋好蓋子，放入ANKOM體外培養(yǎng)箱。48 h后取出濾袋洗凈，65 ℃烘箱中烘干48 h，稱(chēng)至恒重，進(jìn)行干物質(zhì)消化率測(cè)定。青貯原樣營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)試方法與青貯樣相同。

體外干物質(zhì)消化率 = [(m × w) - (m1- m0)]/(m ×w) × 100%。

式中：m0為空白干物質(zhì)量 (g)，m 為樣品質(zhì)量(g)，m1為體外消化后濾袋重 (g)，w為消化前樣品干物質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010做基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理，用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用鄧肯法(Duncan)對(duì)生長(zhǎng)時(shí)期、乳酸菌添加劑及二者之間的交互作用進(jìn)行多重比較。結(jié)果表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋莖葉青貯感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

各組菊芋青貯氣味、結(jié)構(gòu)、色澤及綜合評(píng)分均無(wú)顯著差異 (P ＞ 0.05)(表 2)。綜合評(píng)分都在 16～20分，均為優(yōu)等青貯飼料[11]。

2.2 乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋莖葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

菊芋開(kāi)花期莖葉青貯后pH顯著低于孕蕾前期(P＜0.05)(表 3)，乳酸含量顯著高于孕蕾前期，開(kāi)花期添加乳酸菌組較空白組乳酸含量顯著升高，而孕蕾前期添加乳酸菌后顯著降低了青貯飼料乳酸含量。乳酸菌添加劑處理在兩個(gè)生育期能夠顯著提高乙酸含量，4個(gè)處理中，菊芋孕蕾前期添加乳酸菌乙酸含量最高，而開(kāi)花期對(duì)照組的乙酸含量最低，其他兩個(gè)處理組的乙酸含量則處于中間水平。生育期、乳酸菌添加劑及二者的交互作用對(duì)青貯飼料的氨態(tài)氮/總氮值均有顯著影響。孕蕾前期，乳酸菌添加組氨態(tài)氮/總氮值顯著升高，而在開(kāi)花期其含量顯著降低。

表2 生育期和乳酸菌添加劑對(duì)菊芋青貯感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of lactic acid bacteria addition on the silage quality of Jerusalem artichoke stem and leaf based on sensory evaluation

表3 乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋莖葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria additive on the fermentation characteristics of Jerusalem artichoke stem and leaf silage from different growth stages

2.3 乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋莖葉青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

生育期對(duì)菊芋莖葉青貯的粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分、可溶性糖、單寧含量均有顯著影響(P＜0.05)，對(duì)相對(duì)飼用價(jià)值無(wú)顯著影響。在菊芋孕蕾前期，其莖葉青貯后粗灰分含量顯著高于開(kāi)花期，而可溶性糖含量顯著低于開(kāi)花期 (表 4)。

表4 生育期和乳酸菌添加劑對(duì)菊芋青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria addition on chemical composition of Jerusalem artichoke silage from different growth stages

乳酸菌添加劑處理對(duì)菊芋莖葉青貯中性洗滌纖維、粗灰分、可溶性糖和單寧含量沒(méi)有顯著影響(P ＞ 0.05)，對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響顯著 (P＜0.05)。在菊芋孕蕾前期，添加乳酸菌后顯著降低了其莖葉青貯的粗蛋白，而對(duì)開(kāi)花期沒(méi)有顯著影響。

2.4 乳酸菌添加劑對(duì)不同生育期菊芋莖葉青貯體外干物質(zhì)消化率的影響

生育期、乳酸菌添加劑及二者的交互作用對(duì)青貯飼料的體外干物質(zhì)消化率均有顯著影響(P＜0.05)。在菊芋不同生育期，添加乳酸菌后均顯著降低菊芋莖葉青貯后干物質(zhì)消化率，較對(duì)照組分別降低了7.46%和4.60%。在菊芋不同生育期，添加乳酸菌組莖葉青貯體外干物質(zhì)消化率均顯著低于孕蕾前期。

3 討論

3.1 生育期對(duì)菊芋莖葉青貯發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分及消化率的影響

菊芋在不同生育期其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量有所不同[16]，因此，在做青貯時(shí)，植株的生育期是一個(gè)很重要的影響因素。本研究中，生育期對(duì)青貯飼料pH、乳酸、乙酸、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分、可溶性糖、單寧含量、氨態(tài)氮/總氮及干物質(zhì)消化率都產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)。有機(jī)酸含量是評(píng)價(jià)青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)[17]，發(fā)酵后，pH越低，乳酸含量越高，青貯越容易保存；粗蛋白、粗纖維、可溶性糖含量是重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。本研究中，與孕蕾前期相比，開(kāi)花期青貯飼料有較低的pH和較高的乳酸含量，發(fā)酵品質(zhì)較好，可能原因是開(kāi)花期菊芋青貯原料較孕蕾前期有較高的可溶性糖含量，可溶性糖是乳酸菌發(fā)酵的物質(zhì)基礎(chǔ)，充足的發(fā)酵底物確保乳酸菌大量生成乳酸，加快青貯飼料酸化過(guò)程，促使pH迅速下降，有效抑制不良發(fā)酵，提高青貯品質(zhì)[18]。在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面，開(kāi)花期較孕蕾前期有較低的粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分含量，較高的可溶性糖、單寧含量及相對(duì)飼用價(jià)值。隨著生育期的推進(jìn)，菊芋莖葉青貯粗蛋白含量降低，可能是由于植物原料成熟過(guò)程中葉綠素等蛋白類(lèi)物質(zhì)的降解引起[19]。

3.2 乳酸菌添加劑對(duì)菊芋青貯發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分及消化率的影響

影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的因素有很多，包括原料的水分含量、可溶性碳水化合物含量、青貯溫度、原料表面微生物等[20]。目前，乳酸菌作為添加劑改善青貯品質(zhì)在牧草青貯中已廣泛使用。很多研究表明，牧草青貯時(shí)添加乳酸菌可促進(jìn)青貯乳酸菌的快速積累，降低pH和蛋白質(zhì)分解，獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料[21-22]。但本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料乙酸、粗蛋白含量、氨態(tài)氮/總氮值及干物質(zhì)消化率產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)，孕蕾前期添加乳酸菌顯著降低青貯飼料乳酸、粗蛋白含量及干物質(zhì)消化率，乙酸、氨態(tài)氮/總氮值顯著升高。氨態(tài)氮/總氮值被廣泛用于衡量青貯品質(zhì)的好壞，發(fā)酵時(shí)，植物本身的蛋白分解酶將植物蛋白分解成氨，是造成蛋白質(zhì)損失的主要原因之一[11, 23]，孕蕾前期添加乳酸菌青貯飼料中氨態(tài)氮/總氮值較其他組顯著增加，粗蛋白含量顯著降低，說(shuō)明孕蕾前期添加乳酸菌青貯飼料中不良發(fā)酵較多，粗蛋白降解率較高。綜合以上發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，本研究在菊芋孕蕾前期青貯中添加LAB未得到積極的效果，與薛艷林等[1]、張濤等[21]的研究結(jié)論不一致，但也有研究報(bào)道，接種乳酸菌對(duì)青貯品質(zhì)沒(méi)有顯著影響甚至?xí)档颓噘A品質(zhì)[24-26]。本研究在菊芋孕蕾前期接種乳酸菌并沒(méi)有對(duì)青貯產(chǎn)生積極效果的可能原因是在青貯發(fā)酵初期，首先牧草附著的好氧細(xì)菌、酵母及霉菌等利用殘留氧氣進(jìn)行繁殖，隨著氧氣耗盡，更具競(jìng)爭(zhēng)力、更能適應(yīng)環(huán)境的自身乳酸菌以菊芋原料豐富的可溶性糖為底物迅速繁殖，主導(dǎo)青貯過(guò)程，額外添加乳酸菌可能會(huì)與自身附著乳酸菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，從而抑制乳酸的生成，進(jìn)而影響青貯飼料品質(zhì)[27]。但在開(kāi)花期，青貯飼料添加乳酸菌使pH、氨態(tài)氮/總氮顯著降低，乳酸、乙酸含量顯著升高對(duì)其他指標(biāo)均無(wú)顯著影響(P ＞ 0.05)，說(shuō)明在菊芋開(kāi)花期做青貯飼料時(shí)，添加乳酸菌能使青貯料迅速處于酸性環(huán)境，減少了粗蛋白的分解，使其具有較高的發(fā)酵品質(zhì)。可能原因是，開(kāi)花期菊芋具有較高的可溶性糖含量，發(fā)酵時(shí)，由于自身乳酸菌含量不足，外源添加乳酸菌迅速利用底物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，利于飼料保存；但其體外干物質(zhì)消化率卻顯著低于空白組，這可能與開(kāi)花期具有較高的纖維含量有關(guān)[28]。

3.3 乳酸菌和生育期對(duì)菊芋青貯發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分及消化率的影響

菊芋生育期和乳酸菌添加劑二者的交互作用對(duì)青貯飼料乳酸、乙酸、粗蛋白含量，氨態(tài)氮/總氮值及干物質(zhì)消化率產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)。孕蕾前期添加乳酸菌顯著降低青貯飼料乳酸、粗蛋白含量及干物質(zhì)消化率，乙酸、氨態(tài)氮/總氮值顯著升高；開(kāi)花期添加乳酸菌其青貯飼料乳酸含量顯著升高，氨態(tài)氮/總氮值顯著降低，說(shuō)明在開(kāi)花期添加乳酸菌能改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，而孕蕾前期的菊芋更適合單獨(dú)青貯。這可能是由于開(kāi)花期具有充足的底物，添加乳酸菌后加速對(duì)底物的分解，迅速產(chǎn)酸，改善了青貯品質(zhì)[19]。

4 結(jié)論

綜合感官評(píng)價(jià)和各項(xiàng)青貯發(fā)酵指標(biāo)，在菊芋開(kāi)花期添加乳酸菌能提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，但在孕蕾前期添加乳酸菌對(duì)青貯飼料未產(chǎn)生積極作用；菊芋開(kāi)花期較孕蕾前期做青貯飼料能夠獲得較高的青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。