任倩倩，張京偉，張英杰，劉學(xué)慶，孫紀(jì)霞*

(1.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東煙臺(tái) 265500；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005)

十二卷屬(HaworthiaDuval)是百合科的一種小型的多年生植物，全屬約有150余個(gè)種，大多生長(zhǎng)在南非和西南非地區(qū)，它的名字是為了紀(jì)念一位英國(guó)的植物學(xué)家Adrian Hardn Haworth而得名；它還有另一個(gè)別名叫瓦葦屬[1]，但因與蕨類植物水龍骨科的瓦葦屬名稱一樣，容易混淆所以稱其為十二卷屬的人居多。十二卷屬下的多肉葉子呈披針形三角狀，葉肉飽滿有光澤，淺綠的葉子上會(huì)有彩色的條紋或者星狀斑點(diǎn)[2]。同時(shí)它還有硬葉和軟葉之分，硬葉類葉面常常伴有白色斑點(diǎn)，或結(jié)節(jié)成條狀和縞狀，如條紋十二卷。軟葉類葉子“窗”狀結(jié)構(gòu)更明顯，葉肉看起來更加豐滿并且呈透明狀，邊緣會(huì)有毫毛，如姬玉露[3]。由于十二卷屬獨(dú)特的外形，植株嬌小可愛，在市面上廣受歡迎，深受大家的喜愛，常用于室內(nèi)陳設(shè)，不僅讓人賞心悅目，而且可以凈化空氣環(huán)境，具有環(huán)保的功能[4-7]。

由于十二卷屬植物在亞洲分布較少，且存在繁殖率較低的問題，我國(guó)和韓國(guó)、日本等園藝研究者們一直從海外引進(jìn)十二卷屬的優(yōu)良品種，并在實(shí)現(xiàn)植株的快速繁殖方面進(jìn)行了大量研究[8]。最初采用傳統(tǒng)葉插和底座繁殖等無性繁殖的方法，但是該方法繁殖系數(shù)低、速度慢，無法滿足市場(chǎng)的需求[9]，而且容易損害母本[10]。近幾年，園藝研究人員逐步開始采用組織培養(yǎng)的方法來實(shí)現(xiàn)優(yōu)異品種的快速繁育，取得了顯著的效果，不但可以實(shí)現(xiàn)植株的快速繁殖，而且可以有效地保留良種的觀賞特性[11]。筆者概述了近年來十二卷屬的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)的研究進(jìn)展，包括外植體、基本培養(yǎng)基、激素及其他添加物的選擇，外植體褐變的防治措施以及生根壯苗培養(yǎng)方法等，以期為十二卷屬的生產(chǎn)發(fā)展提供參考。

1 外植體的選擇

近幾年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于多肉研究的文獻(xiàn)越來越多，文獻(xiàn)中研究者們采用各種外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的試驗(yàn)，如種子、新生側(cè)芽、花序 、葉片和子房等。研究表明，在十二卷屬植物的組織培養(yǎng)過程中，外植體選擇不同，愈傷組織的誘導(dǎo)率也有很大差異。起初是國(guó)外的Ogihara[12]采用花蕾作為外植體愈傷組織誘導(dǎo)成功，后來國(guó)外又有研究人員以完整葉片作為外植體也誘導(dǎo)成功[13]。隨之國(guó)內(nèi)許繼勇等[14]在“高地”截形瓦葦組培快繁研究中以花葶作為外植體，實(shí)現(xiàn)了在不損害母本的情況下誘導(dǎo)成功。王泉等[15]在美吉壽組培快繁的試驗(yàn)中以春生子房部位為外植體誘導(dǎo)成功，但是容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。一般在組培快繁體系當(dāng)中，多數(shù)植物組培試驗(yàn)會(huì)使用花莖和子房作為常用的外植體。但是在十二卷屬的組培快繁體系當(dāng)中使用幼嫩花莖或子房作為外植體卻存在著較大的局限性，母本植物開花具有季節(jié)性且需要生長(zhǎng)到一定年限才能開花[16]。同時(shí)新生側(cè)芽、種子、花葶[6，17]、花序和葉片作為外植體也有報(bào)道，也都或多或少地存在著一些局限性，如新生芽發(fā)生在根部，滅菌效果差，容易污染；種子屬雜交產(chǎn)物，獲得的種苗與母本相比變異較大；葉片分生能力弱，分化周期長(zhǎng)，但愈傷組織誘導(dǎo)率和分化培養(yǎng)率高，可以建立快繁體系；花序?yàn)樽钸m外植體，取材方便，不傷害母本，滅菌效果好，愈傷組織誘導(dǎo)率和叢生芽分化率高，獲得的種苗完全保留了母本的優(yōu)良性狀[18-19]。因此十二卷屬的組織培養(yǎng)通常以花序和葉片為外植體，且誘導(dǎo)成功率相對(duì)較高。

2 培養(yǎng)基的選擇

在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是植株生長(zhǎng)分化所必需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。不同外植體和不同生長(zhǎng)發(fā)育階段所需的培養(yǎng)基成分也不相同，如在誘導(dǎo)分化愈傷組織及不定芽、繼代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)等階段，對(duì)培養(yǎng)基的要求不盡相同[16]。在郭生虎等[8]玉露的組培快繁試驗(yàn)中以花序?yàn)橥庵搀w，得出適合玉露離體快繁的技術(shù)體系中最佳愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為MS，而生根階段最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS。而在何佳越等[20]帝玉露組培快繁試驗(yàn)中，利用不同成熟度葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，與郭生虎等的結(jié)論基本一致。因此，十二卷屬植物的基本培養(yǎng)基以MS和1/2MS為最佳。

3 激素的應(yīng)用

一般情況下，十二卷屬的外植體在基本培養(yǎng)基上就可以實(shí)現(xiàn)增殖和分化，但是激素及其他添加物的加入會(huì)促進(jìn)這一進(jìn)程的發(fā)展[21]。目前，在十二卷屬組織培養(yǎng)中常用的激素有KT、6-BA、NAA、IAA、IBA和AC等。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在一定程度上可以直接或間接地調(diào)控植物生化過程甚至精確到每一步的發(fā)展。因此，對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用與添加必須謹(jǐn)慎[22]。

激素的種類和濃度的不同對(duì)外植體的誘導(dǎo)、分化、增殖、壯苗與生根的影響也不盡相同。郭生虎等[8]的多種玉露組培研究中表明，當(dāng)選擇細(xì)胞分裂素(6-BA)為調(diào)節(jié)激素時(shí)，在愈傷組織的誘導(dǎo)過程中低濃度的生長(zhǎng)素有助于叢生芽分化，而高濃度的生長(zhǎng)激素則容易導(dǎo)致叢生芽玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生；在壯苗與生根的過程中，對(duì)玉露的效果IBA優(yōu)于NAA，如果同時(shí)添加IBA和NAA 2種生長(zhǎng)激素時(shí)，IBA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L生根效果最好，同時(shí)與普通毛玉露相比“窗”面更大、更透。張景新等[23]研究證實(shí)，不同激素配比對(duì)冰燈玉露不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)效果有所不同。植株莖的生長(zhǎng)速度會(huì)隨著IAA濃度的增大而增大，當(dāng)IAA濃度達(dá)0.5 mg/L時(shí)，莖高達(dá)到最大，隨著激素濃度的繼續(xù)增加，莖的生長(zhǎng)速度逐漸下降，這時(shí)葉片的厚度也逐漸增加，并出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，所以當(dāng)IAA與BA配比值過大時(shí)不利于莖的快速、健壯生長(zhǎng)。其次，采用固定量高濃度的BA與不同濃度的IAA 組合處理時(shí)，莖的生長(zhǎng)速度和分化情況均不如低濃度BA處理。

張海龍等[24]研究不同激素對(duì)冰燈玉露形態(tài)建成的影響發(fā)現(xiàn)，組培苗在沒有任何添加MS培養(yǎng)基上基本無法正常長(zhǎng)成，而添加一定量的生長(zhǎng)激素IAA卻仍然改善這一狀況，反而導(dǎo)致組培苗出現(xiàn)肉質(zhì)根現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致組培苗的玻璃化；然而當(dāng)添加一定量的BA后，情況發(fā)生轉(zhuǎn)變，組培苗開始朝正常生長(zhǎng)。此試驗(yàn)結(jié)論與以上郭生虎等[8]和張景新等[23]的試驗(yàn)結(jié)論相一致，并確定了激素在組織培養(yǎng)過程中的價(jià)值和重要性。

4 培養(yǎng)條件

外界培養(yǎng)條件也是影響十二卷屬多肉植物的重要因素。光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化具有明顯影響，一般來說光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)越粗壯，相反光照強(qiáng)度較弱時(shí)幼苗容易徒長(zhǎng)。張海龍等[24]研究表明，不同光照強(qiáng)度條件下，組織培養(yǎng)中的幼苗生長(zhǎng)速度和形態(tài)具有很大的變化；當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)3 000 lx時(shí)，幼苗徒長(zhǎng)狀況有所緩解，生長(zhǎng)速度也有所加快；從形態(tài)恢復(fù)率來看，在光照強(qiáng)度為3 000 lx和溫度為20 ℃時(shí)效果最好，同時(shí)組培苗的生長(zhǎng)速度也較快。

5 外植體褐變和玻璃化的預(yù)防措施

植物組織中含有的PPO，作用于酚類物質(zhì)形成醌而引起外植體切口處出現(xiàn)褐變。因此，外植體褐變能否有效地控制是影響組培快繁成功的關(guān)鍵一步[25]。谷延澤等[26]研究認(rèn)為，適當(dāng)?shù)恼诠鈱?duì)抑制外植體褐變現(xiàn)象具有一定的效果，同時(shí)秦李緣等[27]研究得出，最大限度地減少外植體的切口面積，保持切口的平整也會(huì)在一定程度上減少褐變現(xiàn)象的發(fā)生。

在組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和分化過程中愈傷組織和叢生芽經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致組培快繁的失敗，這是組培過程中關(guān)鍵的第二步。玻璃化又稱過度水化[28]，與外植體的選擇、基本培養(yǎng)基的酸堿度、激素的選擇和濃度、外界培養(yǎng)條件中的光照條件和溫度等有關(guān)。細(xì)胞分裂素(6-BA)濃度較高時(shí)玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重，當(dāng)6-BA≤0.5 mg/L、NAA濃度調(diào)整為0.01 mg/L時(shí)，叢生芽基本能解決玻璃化問題，且叢生芽增殖效果較好，郭生虎等[8]在玉露組培快繁試驗(yàn)中驗(yàn)證了這個(gè)觀點(diǎn)。所以在組培過程中適當(dāng)?shù)貎?yōu)化調(diào)節(jié)劑的含量和配比可以有效減少玻璃化現(xiàn)象，有利于提高叢生芽的誘導(dǎo)和增殖率。

6 生根壯苗培養(yǎng)方法

當(dāng)培養(yǎng)皿中的叢生芽生長(zhǎng)成為正常植株以后，就要進(jìn)入壯苗階段，這一階段的培養(yǎng)基配方會(huì)直接決定植株的生根多少，是決定植株移栽能否成活的關(guān)鍵因素。因此，壯苗生根培養(yǎng)基中激素種類和濃度成為業(yè)內(nèi)研究的重點(diǎn)。目前，常用的激素種類主要有NAA、IBA和6-BA等。王婷等[29]研究認(rèn)為，在以1/2MS為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加2 mg/L IBA，最有利于姬玉露愈傷芽生根。而李媛等[30]通過試驗(yàn)證實(shí)，萬象生根培養(yǎng)試驗(yàn)中最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L，同樣，張景新等[23]的冰燈玉露的不定根形成試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，生根率達(dá)100%，單株平均生根數(shù)最高，根系粗壯。不過，在郭生虎等[8]的玉露壯苗生根試驗(yàn)中，得出IBA對(duì)玉露的生根效果優(yōu)于NAA，并且IBA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)生根效果最好，這一結(jié)果支持了王婷等[29]的研究結(jié)論，但也肯定了李媛等[30]和張景新等[23]的研究結(jié)果。至于具體的十二卷屬植物種或品種在這一階段中需要哪種激素及濃度，還需要在今后的試驗(yàn)中加以證實(shí)。

7 組織培養(yǎng)存在的問題及發(fā)展前景

近年來，雖然國(guó)內(nèi)外十二卷屬組培快繁方面的研究越來越多，同時(shí)也取得了一定的成績(jī)，但是十二卷屬植物的諸多品種尚未突破品種快繁的瓶頸問題，繁殖率低、玻璃化和褐化等問題仍然沒有得到很好的解決。而且由于研究的品種、外植體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素、其他添加物的選擇以及外界培養(yǎng)條件等影響因素太多，導(dǎo)致研究的方向和結(jié)果有很多差異。在一定程度上反映了不同品種及外植體對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求不盡相同[22]，因此需要對(duì)這方面進(jìn)行更加細(xì)致的研究，以期能夠建立更加完善的科學(xué)理論體系，更好地實(shí)現(xiàn)十二卷屬稀有品種的大量?jī)?yōu)質(zhì)繁殖，從而使得十二卷屬的原生種及豐富的品種資源得到很好的維持和保護(hù)[31]。此外，近幾年雖然關(guān)于十二卷屬的組培快繁和栽培生理的研究較多，但有關(guān)新品種的選育研究卻很少，品種選育仍未突破傳統(tǒng)的雜交方式的束縛，導(dǎo)致我國(guó)十二卷屬植物大多新品種主要是從國(guó)外引進(jìn)，品種選擇受制于人。因此有必要加強(qiáng)十二卷屬的育種工作，尤其是采用誘變育種、分子標(biāo)記育種等新型育種方式，培育觀賞性強(qiáng)、生長(zhǎng)快且易于栽培的新品種。

與傳統(tǒng)的分株繁殖方式相比，組培快繁突破了自然條件的限制，使多肉植物能夠不受季節(jié)和氣候的影響，在最短的時(shí)間內(nèi)提高繁殖系數(shù)，加快繁殖速度[32]。全年都可以高效、節(jié)能地繁殖出品種優(yōu)良的植株。可以很好地改善十二卷屬中的稀有品種滅絕隱患和無法滿足市場(chǎng)需求的問題。通過組織培養(yǎng)，能使多肉植物進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)前景[33]，能很好地滿足當(dāng)前快速高效發(fā)展的農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化對(duì)種苗大批量和高質(zhì)量的要求，為未來多肉植物的繁殖指引了新的方向[34-35]。同時(shí)在保存多肉植物優(yōu)良的種質(zhì)資源、繁殖名優(yōu)珍稀品種、快速繁殖出口方面具有重要的實(shí)踐意義[22]。