于淼 何其磊 李曉 張鵬翔 馬翠卿

河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室 河北省重大疾病的免疫機(jī)制及干預(yù)重點實驗室,石家莊050017

A 族鏈球菌 (group Astreptococcus,GAS),通過呼吸道傳播后,可引起化膿性扁桃體炎、咽炎、肺炎、鼻竇炎、中耳炎、猩紅熱等侵襲性細(xì)菌感染,兒童20%～30%的急性扁桃體咽炎是由GAS感染引起[1]。在學(xué)齡兒童中,由GAS引起的咽炎的患病率每年可達(dá)到8%～15%。近年來,在中國所處的西太平洋地區(qū),猩紅熱的患病率有增高的趨勢,香港近十年來第一次報道死亡病例,海南報道急性脊髓炎一例[2-3]。雖然,臨床上多采用青霉素及大環(huán)內(nèi)酯類藥物進(jìn)行治療,但近年來由于藥物濫用導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn),使得GAS對抗生素藥物的耐藥率逐年增高,而且,目前全球范圍尚沒有有效的疫苗上市,這使得對GAS的發(fā)病機(jī)制的研究,尋找新的替代治療迫在眉睫。GAS的結(jié)構(gòu)與其致病密不可分,尤其是GAS的表面蛋白在細(xì)菌感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要作用。

1 M蛋白

M 蛋白作為A 族鏈球菌主要致病因子,對于GAS在人體組織和體液中存活起著至關(guān)重要的作用。

1.1 M 蛋白的結(jié)構(gòu) 是由兩條具有α螺旋結(jié)構(gòu)的多肽鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)成的二聚體體蛋白,由C端和N 端組成,其C 端錨定于細(xì)胞表面,靠近C端的區(qū)域為高度保守區(qū);N 端是GAS特異性的基礎(chǔ),含有保護(hù)性抗原表位,而且基本不含人體共同表位,由 A-repeat/N-terminal結(jié)構(gòu)域、B-repeat、C-repeat結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,A 區(qū)為高度變異區(qū),能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生型特異性調(diào)理抗體的抗原決定簇就位于該區(qū),也是血清型(M 型)和基因型 (emm 型)的分類依據(jù);B 區(qū)的變異性比A 區(qū)低,是抗體非結(jié)合區(qū)域;C 區(qū)為高度保守區(qū),攜帶有一定量的自身分子且可能成為廣譜的疫苗[4]。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展,已經(jīng)繪制出一些與人類疾病密切相關(guān)的GAS的基因序列[5]。幾乎所有的M 蛋白基因都含重復(fù)序列,重復(fù)序列的第一和第四位氨基酸一般是疏水殘基形成的螺旋,重復(fù)序列之間有額外的氨基酸殘基,表明M 蛋白可能有一個靈活的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)[6]。M 蛋白的三維結(jié)構(gòu)顯示在氨基末端有四個排列失調(diào)引起的結(jié)構(gòu)缺陷,從而導(dǎo)致應(yīng)有的卷曲結(jié)構(gòu)張開[7]。目前還不清楚這種失調(diào)的生物學(xué)原因,在一些真核來源的蛋白也能觀察到這種現(xiàn)象[8]。

1.2 M 蛋白的致病機(jī)制 可變區(qū)B 域與宿主纖維蛋白原結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)菌入侵[9]。M1 蛋白對幾種半乳糖抗原結(jié)構(gòu)有較高的親和力,M1蛋白通過其B 重復(fù)域結(jié)合宿主細(xì)胞半乳糖結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌入侵[10]。

M 蛋白與粒細(xì)胞的相互作用是其致炎的根本原因。M1蛋白與纖維蛋白原互相結(jié)合后被中性粒細(xì)胞表面的β2結(jié)合素所識別從而激活細(xì)胞導(dǎo)致血管破損,毒性物質(zhì)釋放,從而引起休克綜合征 (streptococcal toxic shock syndrome,STSS)。M1蛋白還可以通過Toll樣受體引起單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha,TNF-α),與纖維蛋白結(jié)合的 M 蛋白通過激活血小板的以及激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,逐步放大它的促炎作用[11-12]。M5還可以作為超抗原誘導(dǎo)大量T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的釋放[13-14],可能會引起猩紅熱和STSS。

M 蛋白還可以激活血凝,促進(jìn)血栓形成,比如 M1和M3型,可以激活人類單核和內(nèi)皮細(xì)胞的外源性的血凝系統(tǒng),同時還有另外一些M 蛋白可以通過結(jié)合激肽原或緩激肽來激活內(nèi)源性的血凝系統(tǒng),兩種不同的血液凝固系統(tǒng)的激活都可以形成血栓[15]。此外M1和M5可以結(jié)合未激活的血小板,這依賴血液中的這兩種蛋白的抗體,該抗體一方面與M1和M5結(jié)合,另一方面與血小板表面的Fc受體結(jié)合,從而激活血小板,促進(jìn)血栓的形成[16]。凝血因子激活也有保護(hù)機(jī)體的作用,其在化膿局部活化可降低并發(fā)癥,改善小鼠M1鏈球菌感染后的生存率[17]。

M 蛋白與機(jī)體的肌球蛋白,層粘連蛋白和角蛋白等,在物理特性和氨基酸的同源性上有較大的相似,刺激抗體產(chǎn)生后可以發(fā)生交叉反應(yīng),在急性腎功能衰竭,鏈球菌后腎小球腎炎等感染后免疫紊亂的疾病發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。比如M 蛋白羧基端重復(fù)區(qū)域有一個特殊的可變區(qū)稱作M 相關(guān)表面蛋白1 (M-associated protein-1,MAP I),與人類心臟上如肌凝蛋白和原肌球蛋白相似,風(fēng)濕類M 蛋白如M5、M6、M12和M24都有此表位[18],導(dǎo)致風(fēng)濕類疾病的發(fā)生。

M 蛋白還是GAS逃逸的重要分子,M 蛋白位于細(xì)菌的絨毛上,遮蓋了細(xì)菌補體受體而阻斷了肝急性蛋白(acute phase protein,ACP)調(diào)理過程[19]。此外,M 蛋白可以與補體系統(tǒng)中的factor H、factor H-like 1、C4結(jié)合蛋白或纖維蛋白原結(jié)合,從而避免了與C3b的結(jié)合,不能觸發(fā)經(jīng)典及旁路的補體激活系統(tǒng),從而對抗機(jī)體的調(diào)理作用,使細(xì)菌逃避被吞噬而存在于感染組織中。另外,其還可通過結(jié)合于抗體的Fc端來逃避被吞噬。M 蛋白有中性粒細(xì)胞吞噬的抗性[20]。例如,M111 蛋白通過抑制活性氧簇(reactive oxygens,ROS)的形成,促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生,從而抑制巨噬細(xì)胞功能[21]。M5 亦誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生,進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)生[22]。還有些M 蛋白可以與血漿凝血酶原結(jié)合從而抑制纖維蛋白的凝集作用,以避免因為纖維蛋白的的聚集而阻止細(xì)菌在血液中的擴(kuò)散[23]。

2 FbaA蛋白

2001年Terao等[24]在化膿性鏈球菌感染的實驗中發(fā)現(xiàn)了一種新的纖連蛋白結(jié)合蛋白Fba A (fibronectin-binding protein a)它與金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronection-binding protein A,FnBPA)同源性很高。且發(fā)現(xiàn)它是在 Mga 調(diào)節(jié)子的控制下轉(zhuǎn)錄的,從而確定了Fba A 是一種新的蛋白。

2.1 Fba A 蛋白的結(jié)構(gòu) 蛋白由雙螺旋的Spy2009基因編碼,Spy2009基因含有1 068個核苷酸,編碼355個氨基酸,相對分子質(zhì)量為37 800,從N 端起是信號肽區(qū),富含脯氨酸區(qū)及C 端的錨定區(qū),存在于鏈球菌的 M1、2、4、9、13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等至少18個血清型中,各型之間的Fba A 蛋白差異不大。

2.2 Fba A 蛋白的致病性 Fba A 是GAS感染的重要毒力因子之一,Fba A 缺陷體的GAS的感染率和致死率明顯降低,提示Fba A 與GAS的感染率和致死率有關(guān)。通過制備分段Fba A 單克隆抗體,初步鑒定抗FbaA2段單克隆抗體與補體調(diào)節(jié)蛋白因子H 和GAS 的結(jié)合區(qū)域有重疊部位,而且Fba A2段蛋白刺激Hep2細(xì)胞后,呈現(xiàn)出自噬相關(guān)蛋白LC3-1、P62隨著時間逐漸降低的趨勢。說明Fba A2段也是Fba A 誘導(dǎo)自噬的主要功能區(qū),而且經(jīng)過后期實驗證明抗Fba A2段單克隆抗體能抑制補體調(diào)節(jié)蛋白因子H 與A群鏈球菌的結(jié)合,從而促進(jìn)了宿主通過自噬消除GAS[25]。

2.3 Fba A 蛋白的免疫原性 Fba A 能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性IgG 滴度,且用Fba A 免疫的小鼠表現(xiàn)出與M 蛋白相同的保護(hù)率,表明Fba A 與M 蛋白在誘導(dǎo)小鼠對GAS激發(fā)的保護(hù)性免疫方面的能力相似[26]。將Fba A 蛋白分段純化后免疫小鼠,以Fba A68～161aa、Fba A104～277aa蛋白組效價升高較為明顯,說明這兩段能更有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[27]。

3 A族鏈球菌C5a肽酶(streptococal C5a peptidase from group A streptococcus,SCPA)

SCPA 是細(xì)菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原,表達(dá)于大多數(shù)A 族鏈球菌表面且高度保守。免疫應(yīng)答強(qiáng),是制備GAS疫苗的候選物。國外科學(xué)家已經(jīng)通過建立一種敏感、特異的酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法,檢測人血清抗SCPA 抗體[28]。

SCPA 可以發(fā)揮補體依賴作用,特異性切割多形核白細(xì)胞 (polymorphonuclear leukocytes,PMNL)的趨化因子C5a,阻止C5a與中性粒細(xì)胞的結(jié)合,抑制炎癥反應(yīng)時吞噬細(xì)胞的攻擊。除此之外,也可與纖連蛋白結(jié)合,作為一種細(xì)菌的侵襲素,加速GAS 對上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲[29-30]。

SCPA 缺失的突變體與野生的GAS有著不同的傳播途徑,SCPA 缺失的細(xì)菌被轉(zhuǎn)運到淋巴結(jié),而野生型鏈球菌不接觸淋巴結(jié)并迅速擴(kuò)散到脾臟[31]。補體級聯(lián)對于清除和控制入侵病原體至關(guān)重要,因此是病原體介導(dǎo)的宿主調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶標(biāo)。C3是補體級聯(lián)的中心分子,并且在細(xì)菌的調(diào)理作用和中性粒細(xì)胞向感染部位的募集中起重要作用。C5a、C3、C3a都可以是SCPA 的底物,在SCPA 的作用下,C3被切割成異常大小功能異常的C3a與C3b,減少了細(xì)菌表面上的C3沉積。C3a的切割導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化,吞噬作用和趨化性的破壞[32]。

4 Sfb蛋白

GAS通過其表面組分如纖維蛋白結(jié)合蛋白 (fibrin binding protein)、纖連蛋白結(jié)合蛋白 (fibronectin binding protein),作為黏附素入侵宿主上皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞。Sfb蛋白 (fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes)是一種纖連蛋白結(jié)合蛋白,暴露于化膿性鏈球菌表面,包括SfbⅠ以及SfbⅡ。在測試的93種鏈球菌中超過55%存在SfbⅡ基因,78%的菌株含有Sfbl基因,86%至少攜帶兩個Sfb基因中的一個。

4.1 SfbⅠ SfbⅠ由37個氨基酸序列組成268個氨基酸的肽閱讀框,完全重復(fù)三次并且第四次不完全重復(fù)。將一個重復(fù)序列構(gòu)建表達(dá)后顯示出纖連蛋白結(jié)合活性的小融合肽,這表明一個重復(fù)含有至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SfbⅠ的結(jié)構(gòu)域與金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白的38-氨基酸D3重復(fù)序列顯示高度同源性,與其他鏈球菌表面蛋白 (包括M 蛋白)的序列比較未能顯示出顯著的同源性。

純化SfbⅠ顯出對纖連蛋白結(jié)合和鏈球菌黏附的強(qiáng)烈競爭性抑制。然而純化的鏈球菌脂磷壁酸僅顯示出弱抑制,表明SfbⅠ直接參與纖連蛋白介導(dǎo)的GAS對上皮細(xì)胞的黏附[33]。SfbⅠ通過內(nèi)部硫酯鍵作為介導(dǎo)與纖維蛋白原中一種特定的賴氨酸殘基反應(yīng),形成非常穩(wěn)定的分子間酰胺鍵,介導(dǎo)GAS黏附到宿主細(xì)胞,進(jìn)而啟動GAS 內(nèi)化的吸收過程[34]。

用含M 蛋白和SfbⅠ兩種抗原的脂質(zhì)核心肽 (the lipld cove peptide,LCP)疫苗對BALB/c小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)免疫接種,在用致死劑量的化膿性鏈球菌菌株進(jìn)行呼吸攻擊后,小鼠受到完全保護(hù),而在分別用LCP-J8 和LCP-FNBR 免疫的小鼠存活率相對低[35]。在基于肽結(jié)合疫苗動物接種實驗中,相比于M1蛋白 (J8)的結(jié)合疫苗,SfbⅠ的表位肽與白喉類毒素的結(jié)合疫苗保護(hù)水平更高[36]。說明SfbⅠ在預(yù)防化膿性鏈球菌上有一定的潛力,而且它特異識別纖維蛋白的靶點也可以有進(jìn)一步的應(yīng)用。

4.2 SfbⅡ SfbⅡ基因來自A 組鏈球菌菌株A75的染色體DNA 的λEMLL3文庫,并編碼113 000蛋白質(zhì),表現(xiàn)出革蘭陽性球菌的膜錨定表面蛋白質(zhì)的特征。蛋白質(zhì)C 末端部分有纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它由兩個半重復(fù)序列組成,它們與其他鏈球菌和葡萄球菌蛋白纖連蛋白結(jié)合蛋白重復(fù)序列具有共同的基序。SfbⅠ、SfbⅡ這兩種蛋白質(zhì)不具有共同的免疫原性表位[37]。

5 血清不透明因子(serum opacity factor,SOF)

SOF表達(dá)在大多數(shù)GAS表面,是GAS重要的毒力因子、黏附素,可以使人血清變不透明及介導(dǎo)細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵襲。SOF是一種纖連蛋白結(jié)合蛋白,分子結(jié)構(gòu)中含有具有纖連蛋白結(jié)合 (Fn結(jié)合)活性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域,陰性突變體中GAS結(jié)合纖連蛋白現(xiàn)象出現(xiàn)大幅度的減少[38-39]。M75的纖連蛋白結(jié)合蛋白SfbⅡ與M22的SOF22基因序列有99%的同一性,僅有4個氨基酸的差異[40]。

SOF通過結(jié)合apo A-Ⅰ和apo A-Ⅱ與人血液中的高密度脂蛋白 (high density lipoprotein,HDL)相互作用導(dǎo)致HDL脂質(zhì)的釋放,其融合形成脂滴,導(dǎo)致血清渾濁化。HDL的破壞可以減弱HDL的抗炎功能,從而有助于GAS致病[41]。

SOF同時也可以與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維蛋白1(fibulin-1)相互作用,纖連蛋白、纖維蛋白與SOF結(jié)合的結(jié)構(gòu)域是分開且不同的,而纖連蛋白,fibulin-1,纖維蛋白原和SOF形成的分子復(fù)合物,增強(qiáng)了GAS對宿主細(xì)胞黏附侵襲的能力[42]。另外,SOF是fibulin-1蛋白的受體,但并不是唯一受體[43]。研究顯示,SOF可以激發(fā)宿主產(chǎn)生調(diào)理性抗體,M2和SOF2蛋白的抗血清的組合在殺滅鏈球菌方面比單獨的抗血清更有效,并且SOF的不同血清型具有共同的表位,因此SOF是預(yù)防A 族鏈球菌感染的候選疫苗之一[44]。

6 A族鏈球菌類膠原蛋白(streptococcal collagen-like,SCL)

SCL有兩種,結(jié)構(gòu)相似,Lukomski等[45]稱之為SCL1和SCL2,而Rasmussen等稱之為SCLA 和SCLB[46]。SCL的胞外部分為N 末端非膠原可變區(qū) (V 區(qū))和一個由重復(fù)的GXY (G：甘氨酸;XY：代表其他氨基酸)三聯(lián)體組成的類膠原區(qū) (CL區(qū))形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。在羧基端為保守的細(xì)胞壁區(qū) (W 區(qū))。

構(gòu)建重組Scl1 (rScl1.41)后發(fā)現(xiàn)其CL 區(qū)可以和人的膠原蛋白受體結(jié)合,如a2b1整聯(lián)蛋白,rScl1.41與整聯(lián)蛋白的結(jié)合可促進(jìn)人的肺纖維原細(xì)胞的吸附與擴(kuò)散,引起細(xì)胞內(nèi)一些與整聯(lián)蛋白相關(guān)的信號分子的磷酸化,如黏著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)、丙酮酸激酶 (pyruvic kinase 2,Py K2)、整聯(lián)蛋白連接激酶1 (integrin-linked kinase 1,ILK-1)等[47]。同時某些CL區(qū)含有GLPGER 模體的Scl1可以和a2b1及a11b1結(jié)合[48]。

一些證據(jù)表明低密度脂蛋白 (low density lipoprotein,LDL)在防御病原微生物感染方面具有的積極的作用[49-50]。而rScl1的V 區(qū)與ApoB100和LDL可以特異性結(jié)合,且具有濃度依賴性。但是這種相互作用是有利于機(jī)體的抗感染作用還是有利于病菌入侵,還有待于進(jìn)一步的研究[51]。凝血酶激活的纖溶抑制劑 (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI)可通過Scl1.41、Scl2.41與鏈球菌結(jié)合,并且在GAS菌體表面被激活?；钚訲AFI是纖維蛋白溶解作用的抑制因子,并且可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。SCL 與補體調(diào)節(jié)蛋白H 因子有相互作用,GAS可以通過與H 因子的結(jié)合而避免補體介導(dǎo)的調(diào)理作用和吞噬作用。同時SCL 與H因子結(jié)合補體C3b的裂解有輔助作用[52],有助于GAS逃逸宿主機(jī)體的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。

7 FBP54

纖維蛋白原結(jié)合蛋白 (fibrinogen binding protein,FGN)纖連蛋白 (fibronectin,FN)是細(xì)菌與宿主細(xì)胞結(jié)合的受體。除先前提到的多種表面蛋白,FBP54也是一種可以與纖連蛋白以及纖維蛋白原結(jié)合的表面蛋白。該蛋白有54 000,通過構(gòu)建融合蛋白表明,FBP54的FN/FGN 結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含在N 端殘基1～89[53]。并且FBP54在宿主體內(nèi)優(yōu)先介導(dǎo)對某些細(xì)胞的黏附。

實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)FBP54以劑量相關(guān)的方式作用于人頰上皮細(xì)胞,阻斷對人頰上皮細(xì)胞80%的黏附時,FBP54對A組鏈球菌與HEp-2組織培養(yǎng)細(xì)胞的黏附幾乎沒有影響。鏈球菌感染后腎小球腎炎和急性風(fēng)濕熱的患者血清有FBP54在體內(nèi)表達(dá)且在人宿主中具有免疫原性[54]。

8 小結(jié)與展望

到目前為止,相關(guān)學(xué)者對GAS致病機(jī)制的研究一直未曾停止過,從上述研究中,可以看出GAS致病機(jī)制的復(fù)雜性,其表面蛋白不僅可以介導(dǎo)細(xì)菌與機(jī)體的結(jié)合,引起炎癥反應(yīng),增加致病性,亦可以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別使細(xì)菌擴(kuò)散。希望我們對表面蛋白的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的致病機(jī)制的研究綜述,尋找更好的治療GAS感染方法,能夠為防御GAS感染、尋找更好的治療方法提供新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突