范銀星 柴榮 韓一平

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸與危重癥科,上海 200433

免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICPis)近年來(lái)發(fā)展迅速,其中細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxie T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性細(xì)胞死亡受體1/配體1(programmable cell death protein 1/L1,PD-1/L1)抑制劑是最主要的2種[1]。多種腫瘤的臨床研究結(jié)果證實(shí),ICPis一旦產(chǎn)生應(yīng)答,有實(shí)現(xiàn)腫瘤長(zhǎng)期控制的可能[2-3],但伴發(fā)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)(immune-related adverse events,irAE)常成為ICPis應(yīng)用的阻礙。因此,深入研究irAE發(fā)生的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)具有早期預(yù)測(cè)作用的生物標(biāo)記物對(duì)提高ICPis的有效性、安全性和耐受性具有重要意義。本文從irAE 的概況、irAE 的發(fā)生機(jī)制及預(yù)測(cè)irAE的標(biāo)記物3個(gè)方面對(duì)irAE 研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 irAE的概況

irAE是由免疫系統(tǒng)非特異性激活引起的,全身系統(tǒng)均可受累,大部分irAE 程度較輕且可逆,也有部分irAE 存在致命可能,ICPis治療初始的6個(gè)月內(nèi)是發(fā)生irAE 的高峰期[4-5],但治療全程乃至治療結(jié)束后均有發(fā)生irAE 的風(fēng)險(xiǎn)。Wang等[6]的meta分析顯示,3 545例ICPis治療患者的總體死亡率為0.6%,最主要的致死原因有結(jié)腸炎、神經(jīng)毒性、肺炎、肝炎和心肌炎。不同ICPis的irAE 發(fā)病情況差異較大,通常CTLA-4抑制劑irAE發(fā)生率和嚴(yán)重程度均高于PD-1/L1抑制劑[7]。約90%CTLA-4治療患者會(huì)發(fā)生不同程度的irAE,嚴(yán)重irAE 的發(fā)生率為10%～42%,PD-1/L1抑制劑irAE 總發(fā)生率約70%,11%～20%的患者表現(xiàn)較為嚴(yán)重[8]。對(duì)于ICPis聯(lián)合治療,嚴(yán)重irAE 的發(fā)生率明顯增高[9]。目前,irAE的治療多基于臨床經(jīng)驗(yàn),多家權(quán)威腫瘤治療機(jī)構(gòu)已發(fā)布了irAE 的臨床管控指南[10-11]。治療根據(jù)不良反應(yīng)通用術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)分4個(gè)等級(jí),輕度irAE 無(wú)需停藥,僅需對(duì)癥處理或口服小劑量激素;中重度irAE 治療首先需停用ICPis,之后根據(jù)具體表現(xiàn)選擇激素或免疫抑制劑等多種治療方法。

2 irAE發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展

ICPis引發(fā)irAE的機(jī)制尚不清楚,現(xiàn)研究表明有多種機(jī)制參與其中,包括ICPis與非腫瘤組織上的靶分子結(jié)合誘導(dǎo)下游的免疫反應(yīng),新型T 細(xì)胞或耗竭T 細(xì)胞對(duì)非靶組織上有交叉反應(yīng)的抗原再次激活,自身抗體以及炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。

2.1 非腫瘤組織表達(dá)ICPis識(shí)別的靶點(diǎn) 不同ICPis引發(fā)的irAE 表現(xiàn)出顯著的器官特異性,CTLA-4抑制劑相關(guān)腸炎和垂體炎發(fā)生率比PD-1/L1抑制劑高6～9倍,而PD-1/L1抑制劑相關(guān)肺炎和甲狀腺炎發(fā)生率比CTLA-4 抑制劑高6倍[12],這可能與不同組織表達(dá)免疫檢查點(diǎn)組分的差異相關(guān)。Iwama等[13]研究發(fā)現(xiàn),小鼠反復(fù)接受CTLA-4單抗注射后,垂體出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),外周血垂體抗體水平升高,在20例黑色素瘤患者中同樣發(fā)現(xiàn),采用Ipilimumab前所有患者外周血垂體抗體均為陰性,治療后發(fā)生垂體炎的7例患者垂體抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,而未發(fā)生垂體炎的13例患者垂體抗體仍為陰性。該研究間接證實(shí)垂體組織細(xì)胞可能表達(dá)某種特異性抗原,被CTLA-4單抗激活的T 細(xì)胞識(shí)別后產(chǎn)生了垂體抗體,從而導(dǎo)致垂體炎。Caturegli等[14]的研究則直接證實(shí)垂體細(xì)胞中表達(dá)的CTLA-4抗原起到新抗原的作用,與外源性CTLA-4抗體結(jié)合引發(fā)免疫反應(yīng),破壞垂體實(shí)質(zhì)導(dǎo)致垂體炎的發(fā)生。該研究組收集6 例接受過(guò)Ipilimumab治療的患者尸檢的垂體切片,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)垂體前葉素、免疫細(xì)胞、免疫球蛋白、補(bǔ)體和CTLA-4抗原表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)生嚴(yán)重垂體炎的患者CTLA-4抗原水平最高,且CTLA-4抗原的高表達(dá)與T 細(xì)胞浸潤(rùn)和IgG 依賴性補(bǔ)體結(jié)合以及吞噬作用呈正相關(guān)性。其他組織器官是否因表達(dá)類似ICPis可識(shí)別的靶點(diǎn)導(dǎo)致irAE,仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 ICPis誘發(fā)新抗原特異性T 細(xì)胞或先前休眠的抗原特異性T 細(xì)胞的重新激活 一項(xiàng)ICPis聯(lián)用引發(fā)嚴(yán)重心肌炎的研究發(fā)現(xiàn)[15],炎性改變的心肌細(xì)胞中有大量CD4+、CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn),而沒(méi)有B細(xì)胞或自身抗體,且浸潤(rùn)心肌和腫瘤組織的T 細(xì)胞屬于同一克隆,表明心肌和腫瘤組織表達(dá)的共同抗原可激活這種特異性T 細(xì)胞從而引發(fā)心肌炎。Shirali等[16]報(bào)道,6例有長(zhǎng)期服用致腎炎風(fēng)險(xiǎn)藥物病史的非小細(xì)胞肺癌患者,在采用Nivolumab一定療程后均出現(xiàn)急性間質(zhì)性腎炎。Koda等[17]也有類似的個(gè)案報(bào)道,兩項(xiàng)研究的腎穿結(jié)果均發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)中有大量CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn),由此認(rèn)為,PD-1抑制劑可能重新激活了原本對(duì)致腎炎藥物免疫耐受的效應(yīng)性T 細(xì)胞的活性,使其產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)引起腎功能損傷。以上研究中大部分患者停用致腎炎藥后腎功能可部分自行恢復(fù),亦證實(shí)了這種假說(shuō)的合理性。

2.3 自身抗體的產(chǎn)生 Osorio等[18]研究發(fā)現(xiàn),80%治療前抗甲狀腺抗體陽(yáng)性的患者在pembrolizumab治療過(guò)程中發(fā)生了自身免疫性甲狀腺炎,表明PD-1抑制劑可增強(qiáng)先前存在的抗甲狀腺抗體活性,這可能是甲狀腺irAE的重要病因。另外,抗雙鏈DNA 和抗核抗原抗體是自身免疫性疾病常見(jiàn)的致病性抗體,Fadel等[19]報(bào)道,采用Ipilimumab 2個(gè)療程后出現(xiàn)了狼瘡樣腎小球腎炎的患者,外周血中檢測(cè)出抗雙鏈DNA 和抗核抗原抗體,這些自身抗體在停藥3個(gè)月后自行轉(zhuǎn)陰,患者的腎功能也逐步恢復(fù)正常,進(jìn)一步表明自身抗體致irAE的可能。新近,Das等[20]研究發(fā)現(xiàn),接受ICPis聯(lián)合治療的黑色素瘤患者外周血循環(huán)B 細(xì)胞總數(shù)顯著少于單藥治療患者,但漿細(xì)胞比例顯著升高。漿細(xì)胞是分泌介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)抗體的主要細(xì)胞,這可能是ICPis聯(lián)合治療irAE發(fā)生率高的原因之一。至今相關(guān)研究較少,但綜上所見(jiàn),自身抗體在irAE的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

2.4 細(xì)胞因子的產(chǎn)生 irAE 是一種自身免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng),細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要的作用。IL-17主要由輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell17,Th17)分泌,它是一種促炎細(xì)胞因子,已被證實(shí)在多種自身免疫疾病中發(fā)揮作用。CTLA-4抑制劑可激活多種T 細(xì)胞亞型,包括Th17,從而刺激IL-17分泌誘發(fā)自身免疫反應(yīng)[21]。Tarhini等[22]報(bào)道,Ipilimumab治療黑色素瘤并發(fā)腸炎的患者血中IL-17 顯著升高。在CTLA-4 相關(guān)腸炎小鼠模型外周血中也觀察到IL-17的升高[23],這些研究為IL-17阻滯劑治療ICPis相關(guān)腸炎提供了一定的理論支持。但I(xiàn)L-17阻滯劑有減弱ICPis抗腫瘤作用的風(fēng)險(xiǎn)[24],也需引起足夠的重視。也有其他細(xì)胞因子的相關(guān)研究,Johnson等[15]研究發(fā)現(xiàn),ICPis相關(guān)心肌炎患者的心臟、骨骼肌和腫瘤細(xì)胞中,包括趨化因子配體10 在內(nèi)的多種炎性因子的RNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。Murakami等[25]報(bào)道,ICPis相關(guān)急性間質(zhì)性腎炎患者血漿中促炎因子IL-1Ra、趨化因子配體10和腫瘤壞死因子均顯著升高。不同的細(xì)胞因子在irAE的發(fā)生過(guò)程中具體起到何種作用還需要進(jìn)一步深入研究。

irAE的發(fā)生主要與免疫功能紊亂相關(guān),而其表現(xiàn)出的異質(zhì)性,包括受累器官的廣泛性,臨床表現(xiàn)的多樣性以及嚴(yán)重程度的差異性均提示以上的研究結(jié)果不能完全解釋irAE的發(fā)生機(jī)制,未來(lái)需要更加全面深入的觀察與研究。

3 irAE的預(yù)測(cè)標(biāo)記物

隨著irAE發(fā)病機(jī)制研究的深入,irAE 預(yù)測(cè)標(biāo)記物的相關(guān)研究發(fā)展迅速,目前已發(fā)現(xiàn)腸道菌群、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、基因突變多態(tài)性、自身抗原抗體以及某些炎性因子具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

3.1 腸道菌群成分的改變 人體腸道內(nèi)大約寄生著1 014個(gè)細(xì)菌,共有約300～1 000個(gè)不同種類,統(tǒng)稱為腸道共生菌群,這些菌群的基因總數(shù)是人體基因的100倍[26]。腸道菌群參與人體多種病理生理過(guò)程,在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答方面有重要的作用[27]。腸道菌群對(duì)ICPis治療有效性和毒性反應(yīng)的影響近年來(lái)受到極大的關(guān)注。Vétizou 等[28]發(fā)現(xiàn),腸道無(wú)菌的MCA205肉瘤小鼠經(jīng)強(qiáng)飼脆弱擬桿菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌后腹腔注射CTLA-4單抗,20 d后小鼠結(jié)腸黏膜微損傷程度明顯輕于未強(qiáng)飼細(xì)菌的小鼠。這種保護(hù)作用被認(rèn)為與脆弱擬桿菌調(diào)動(dòng)樹(shù)突狀細(xì)胞,促進(jìn)黏膜上的可誘導(dǎo)共刺激分子表達(dá)的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)增殖有關(guān)[29]。Sivan等[30]報(bào)道,通過(guò)給小鼠強(qiáng)飼或糞菌移植雙歧桿菌,可明顯增強(qiáng)PD-1/L1抑制劑控制腫瘤生長(zhǎng)的作用,并減輕細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌處理后的小鼠腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)了大量CD8+T 細(xì)胞和腫瘤特異性T 細(xì)胞,提示雙歧桿菌是以非抗原依賴性方式改善小鼠抗腫瘤免疫功能。

來(lái)自人群的相關(guān)研究證實(shí)了腸道菌群的作用。Routy等[31]發(fā)現(xiàn),在ICPis治療前或治療初始應(yīng)用廣譜抗生素與未用抗生素的患者相比,疾病無(wú)進(jìn)展時(shí)間(3.5月比4.1月,P=0.017)和總生存期(11.5月比20.6月,P＜0.001)均顯著縮短,這種負(fù)性作用可能與廣譜抗生素破壞腸道菌群組成相關(guān)。Dubin等[32]報(bào)道,Ipilimumab治療的黑色素瘤患者中,擬桿菌門(mén)細(xì)菌比例高的患者發(fā)生腸炎的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低,機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),缺乏細(xì)菌多胺轉(zhuǎn)運(yùn)和B組維生素合成的遺傳途徑與結(jié)腸炎風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Chaput和Frankel等[33-34]均發(fā)現(xiàn),Ipilimumab治療的患者糞菌類群中,厚壁菌門(mén)的瘤胃菌科(如普拉梭菌)的豐度較高而擬桿菌門(mén)豐度低的患者發(fā)生結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)更高。以上研究均證實(shí)腸道菌群對(duì)ICPis治療存在重要的影響,檢測(cè)腸道菌群的組成是預(yù)測(cè)ICPis 有效性和irAE 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在方法。16sRNA 測(cè)序平臺(tái)是常用的檢測(cè)細(xì)菌種類的方法,但由于平臺(tái)及患者個(gè)體差異較大,目前不能明確具有改善預(yù)后作用的菌群,但通過(guò)服用或糞菌移植具有改善預(yù)后作用的菌群提高ICPis治療的有效性,降低irAE 的發(fā)生率,將是未來(lái)研究的重要方向。

3.2 外周血和腫瘤微環(huán)境中不同亞型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 目前關(guān)于Tregs、嗜酸粒細(xì)胞和B細(xì)胞的研究較多。Tregs是效應(yīng)性T 細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞,生理情況下主要參與維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。腫瘤浸潤(rùn)性Tregs可以上調(diào)腫瘤微環(huán)境中PDL-1、PDL-2、IL-1R2和趨化因子受體8 等負(fù)性免疫檢查點(diǎn)的表達(dá),幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。研究表明,CTLA-4單抗發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑之一就是選擇性減少瘤內(nèi)Tregs[35],同時(shí),也是導(dǎo)致自身免疫易感性的增加的原因[36]。Liu等[37]報(bào)道,Tregs的消耗可能是受累器官中效應(yīng)性T 細(xì)胞增加和血液中干擾素-γ及腫瘤壞死因子水平升高介導(dǎo)的。另外,Tregs在腸道免疫耐受中也有重要的作用,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些腸道共生菌如普拉梭菌可增加Tregs水平,這可能是腸道某些共生菌群導(dǎo)致腸炎風(fēng)險(xiǎn)增高的機(jī)制之一[33]。

關(guān)于嗜酸粒細(xì)胞,Jaber等[38]報(bào)道,抗CTLA-4 治療發(fā)生皮膚irAE的患者外周血和受累皮膚中嗜酸粒細(xì)胞顯著增加。雖然PD-1/L1抑制劑治療尚未發(fā)現(xiàn)類似的關(guān)聯(lián)[39],但在對(duì)ICPis聯(lián)合治療導(dǎo)致的皮膚紅斑病理活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)不同程度的嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[40],均提示嗜酸粒細(xì)胞有作為潛在預(yù)測(cè)因子的可能。

B細(xì)胞也在irAE中發(fā)揮了作用,Das等[20]發(fā)現(xiàn),ICPis聯(lián)合治療早期,外周血B細(xì)胞的變化與3/4級(jí)irAE顯著相關(guān),發(fā)生3/4級(jí)irAE患者的B細(xì)胞總數(shù)下降,但記憶性B 細(xì)胞亞型CD21lowB 細(xì)胞和漿細(xì)胞比例上升,CD21lowB細(xì)胞表面淋巴組織歸巢相關(guān)因子CXCR4 和CXCR5表達(dá)水平較低,表明CD21lowB 細(xì)胞向非淋巴組織浸潤(rùn)的能力較強(qiáng),可能有助于介導(dǎo)的炎癥發(fā)生。因此,外周血B細(xì)胞計(jì)數(shù)和B 細(xì)胞亞型分析有預(yù)測(cè)irAE 發(fā)生的潛在價(jià)值。檢測(cè)免疫細(xì)胞預(yù)測(cè)irAE仍處于初始階段,但新型流式細(xì)胞分析平臺(tái)可以以生物學(xué)相關(guān)行為定義免疫細(xì)胞亞群,為明確具有預(yù)測(cè)價(jià)值的免疫細(xì)胞亞型提供了可能[41]。

3.3 基因多態(tài)性 CTLA-4和PD1/PD-L1通路在抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞活性和維持機(jī)體免疫耐受中起關(guān)鍵作用,CTLA-4基因功能性突變很常見(jiàn),這是宿主維持對(duì)病毒或胞內(nèi)感染抵抗性的重要機(jī)制[42]。有研究發(fā)現(xiàn),CTLA-4和PD1/PD-L1的這種基因多態(tài)性與多種自身免疫疾病相關(guān)[43-44]。而irAE與自身免疫性疾病有很多相似的臨床表現(xiàn),可見(jiàn)CTLA4和PD1/PDL-1通路以及其他免疫調(diào)節(jié)途徑的基因變異對(duì)irAE 的易感性有潛在的預(yù)測(cè)作用。Patil等[45]對(duì)ICPis治療的黑色素瘤患者的腫瘤樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)突變基因在發(fā)生結(jié)腸炎的患者中富集。基因組全外顯子測(cè)序檢測(cè)腫瘤突變負(fù)荷已被證實(shí)有預(yù)測(cè)ICPis有效性的作用[46],類似的方法是否可預(yù)測(cè)irAE仍需深入研究。

3.4 自身抗原抗體 在ICPis治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)某些自身特異性抗原抗體的變化可能是預(yù)測(cè)irAE 的有效方法。Kobayashi等[47]研究證實(shí),在Nivolumab治療開(kāi)始后的24周內(nèi),甲狀腺irAE在抗甲狀腺抗體陽(yáng)性組(3/6)的發(fā)生率顯著高于抗體陰性組(1/60)(P＜0.001)。一項(xiàng)Ipilimumab聯(lián)合卡介苗治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的1期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[48],2例發(fā)生嚴(yán)重irAE的患者外周血中自身抗體水平顯著升高,而且這些自身抗體在irAE出現(xiàn)之前即已被檢測(cè)到,表明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)自身抗體譜可能是預(yù)測(cè)irAE 的方法。目前蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)針對(duì)大量靶標(biāo)的特異性抗體,應(yīng)用這種技術(shù)對(duì)比發(fā)生和未發(fā)生irAE患者循環(huán)自身抗體的差別和治療過(guò)程中自身抗體水平的變化,可從中篩選潛在的預(yù)測(cè)irAE標(biāo)記物。

3.5 免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子 IL-17在腸道irAE發(fā)生過(guò)程中起到了重要的作用[22-23],Tarhini等[49]研究發(fā)現(xiàn),如IL-17基線水平較高,則Ipilimumab治療引發(fā)3～4級(jí)結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)增加,表明IL-17 有腸道irAE 預(yù)測(cè)價(jià)值。Fujimura等[50]對(duì)Th17另一個(gè)標(biāo)記物趨化因子配體5和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物可溶性CD163 的研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生irAE的患者組血漿可溶性CD163和CXCL5較基線顯著升高,提示可溶性CD163和趨化因子配體5可能有預(yù)測(cè)irAE的作用。Matsuo等[51]評(píng)估PD-1抑制劑應(yīng)用前后外周血中88種可溶性免疫介質(zhì)水平的變化與預(yù)后和irAE 的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),治療前后外周血CXCL2水平下降和基質(zhì)金屬蛋白酶2水平上升的患者無(wú)進(jìn)展時(shí)間和總生存期顯著延長(zhǎng),而irAE發(fā)生率也相對(duì)較高。以上研究提示細(xì)胞因子與irAE的發(fā)生存在密切的關(guān)系,但距離應(yīng)用于預(yù)測(cè)irAE的發(fā)生還有很長(zhǎng)的路要走。

4 展望

ICPis的臨床應(yīng)用發(fā)展迅速,不同ICPis的聯(lián)合,與化療、放療、靶向藥物、血管內(nèi)皮抑制劑等其他治療方法的聯(lián)合以及可手術(shù)患者的早期輔助治療的臨床試驗(yàn)正如火如荼的開(kāi)展,ICPis未來(lái)必將全面改變多種腫瘤的治療策略。irAE無(wú)疑是拓展ICPis應(yīng)用的阻礙,目前我們對(duì)irAE的研究尚淺,但最新的DNA、RNA、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)技術(shù)可以幫助我們逐步了解irAE 發(fā)生的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)irAE 的標(biāo)記物,篩選出irAE 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高的患者,最終達(dá)到提高ICPis治療的安全性與有效性的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突