陳茜,韋志強(qiáng),徐曉雪,譚超群,范文翔,吳純潔,袁星

(成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 611137)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，蕓香科花椒屬植物，主產(chǎn)于四川、甘肅、陜西、山東、河北等地[1]?；ń纷鳛槲覈?guó)的“調(diào)八味”之一，因其獨(dú)特的麻味，廣泛用于川菜調(diào)味。果皮顏色作為花椒主要的感官指標(biāo)之一，對(duì)其外觀品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要意義?；ń饭ゎ伾善鋬?nèi)含多種色素類成分的相對(duì)含量共同決定，其中花椒果皮綠色部位主要與葉綠素含量有關(guān)[2-4]；果皮黃色部位主要與黃酮類成分含量有關(guān)，以槲皮素類黃酮苷為主[5,6]；果皮紅色部位主要與花青素類成分有關(guān)[7]?，F(xiàn)代研究表明，包括黃酮、多酚、花青素、葉綠色等在內(nèi)的多種色素類成分具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老等[8-13]。

目前，花椒的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[14]、氣相色譜法(GC)[15]、紫外光譜分析法(UV)[16]等，以上分析方法具有一定破壞性、費(fèi)用高、耗時(shí)多等缺點(diǎn)。機(jī)器視覺(jué)(CV)利用圖像處理技術(shù)獲得樣品外觀特征參數(shù)，將樣品顏色信息數(shù)字客觀化，具有無(wú)損、低耗、快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域中[17]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，花椒顏色與其內(nèi)在成分存在著一定相關(guān)性。Tao等研究發(fā)現(xiàn)花椒顏色與揮發(fā)油、總酰胺以及雜質(zhì)含量間具有顯著相關(guān)性，并且通過(guò)顏色分析快速檢測(cè)了揮發(fā)油、總酰胺以及雜質(zhì)的含量，實(shí)現(xiàn)了花椒品質(zhì)的分級(jí)[18]。郭換等研究表明花椒顏色與其黃酮類成分具有一定相關(guān)性，認(rèn)為可通過(guò)花椒顏色的測(cè)定為其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

花椒色素類成分是花椒顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)，可作為花椒品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要參考指標(biāo)。目前尚未有花椒色素類成分的快速無(wú)損分析方法，因此，本研究采用機(jī)器視覺(jué)技術(shù)獲得不同來(lái)源花椒的顏色值，探討顏色值與花椒中黃酮、多酚、花青素、葉綠素含量間的相關(guān)性，借助人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(ANN)通過(guò)顏色值快速預(yù)測(cè)花椒色素類成分含量(見(jiàn)圖1)，為花椒色素類成分的快速無(wú)損檢測(cè)提供新方法，為花椒品質(zhì)的快速無(wú)損評(píng)價(jià)提供參考與借鑒。

圖1 CV-ANN技術(shù)快速預(yù)測(cè)花椒色素類成分含量技術(shù)路線圖Fig.1 The scheme design for fast prediction of pigments content of Zanthoxylum bungeanum using CV-ANN

1 儀器和材料

Autoscience AS 5150A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器 成都超純科技有限公司；BP211D型電子分析天平 德國(guó)賽多利斯股份有限公司；HX-200型粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；LXJ-Ⅱ離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng) 自制。

對(duì)照品蘆丁、沒(méi)食子酸、矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷：購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；水：超純水；甲醇、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、福林酚試劑、碳酸鈉、丙酮等：均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

本次試驗(yàn)收集了四川漢源、陜西韓城、甘肅宜東、甘肅秦安、甘肅武都、安徽亳州藥材市場(chǎng)、康美藥業(yè)股份有限公司的花椒樣品，共60批，見(jiàn)表1。

表1 不同來(lái)源花椒樣品信息Table 1 Information of Zanthoxylum bungeanum from different sources

2 方法與結(jié)果

2.1 顏色測(cè)定

2.1.1 機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)的構(gòu)建

如自學(xué)習(xí)《鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)》時(shí)，鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)打開(kāi)了我國(guó)的大門(mén)，為我國(guó)帶來(lái)了侵略、傷害。但同時(shí)進(jìn)了我國(guó)自然經(jīng)濟(jì)的解題，讓我過(guò)從封閉天國(guó)轉(zhuǎn)變出來(lái)，開(kāi)始面向社會(huì)。它也成為了我國(guó)現(xiàn)代史的開(kāi)端，所以學(xué)生不能夠從單一的角度去認(rèn)識(shí)和學(xué)習(xí)它，而要從辯證的角度去看待它。

本實(shí)驗(yàn)的機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)(自制)包括圖像采集系統(tǒng)與智能計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)。就圖像采集系統(tǒng)而言，光源穩(wěn)定性是保證樣品顏色客觀量化的重要條件，本圖像采集系統(tǒng)選用封閉式拍照箱，以白色為背景，以日光燈(Philips Master TL-D 90 De Luxe 18 W/950)作為光源，以排除外界環(huán)境光的干擾，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：色溫為5000 K。以配有鏡頭(EF-S 60 mm f/2.8)的佳能相機(jī)(EOS 60D，Canon Inc.，Japan)作為圖像采集儀器，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：像素為5184×3456；光圈值：8；曝光時(shí)間：1/13 s；感光度(ISO)：200；顏色表示：sRGB顏色空間模型。智能計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)是機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)將顏色數(shù)字化的關(guān)鍵與核心。由圖像采集系統(tǒng)前期采集得到的圖像，首先采用閾值分割算法扣除白色背景獲得樣品特征區(qū)域，然后利用計(jì)算機(jī)提取該樣品區(qū)域每個(gè)像素點(diǎn)的R(紅色)、G(藍(lán)色)、B(綠色)值，并通過(guò)顏色轉(zhuǎn)換公式將sRGB顏色空間模型轉(zhuǎn)化成CIE L*、a*、b*顏色空間模型(L*值為亮度，a*為紅色至綠色的范圍，b*為黃色至藍(lán)色的范圍)。

2.1.2 光源穩(wěn)定性考察

稱取5 g漢源花椒顆粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)中，放入機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)封閉式拍照箱，使花椒樣品擺放于相機(jī)視野中央，在同一拍攝角度，每隔一定時(shí)間拍攝1次，在90 min內(nèi)采集圖像，載入智能計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定顏色值，確定光源穩(wěn)定時(shí)間。

圖2 光源穩(wěn)定性考察Fig.2 Study on the stability of light sources

由圖2可知，顏色R、G、B值的在60 min后趨于穩(wěn)定，燈光穩(wěn)定時(shí)間為60 min，所以樣品顏色測(cè)量確定為系統(tǒng)燈光打開(kāi)60 min以后開(kāi)始執(zhí)行。

2.1.3 精密度考察

花椒拍攝取樣前，打開(kāi)燈光60 min使光源趨于穩(wěn)定，光源穩(wěn)定后，進(jìn)行正式拍攝取樣。稱量5.0 g漢源花椒顆粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)，放入機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)封閉式拍照箱中，使樣品擺放于相機(jī)視野中央，于同一拍攝角度進(jìn)行圖像取樣，重復(fù)拍攝6次。將圖像導(dǎo)入圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行顏色特征提取，分別輸出R、G、B顏色值。3個(gè)顏色量度值的RSD分別是0.49%，0.45%，0.41%，說(shuō)明顏色測(cè)定方法精密度良好。

2.1.4 花椒顏色測(cè)定

不同來(lái)源的花椒樣品顏色表現(xiàn)出明顯差異，從深紅色到黃褐色各不相同，其中以漢源花椒顏色最紅，亳州藥材市場(chǎng)所購(gòu)花椒的顏色則更偏于黃褐色。不同來(lái)源花椒樣品的CIE L*、a*、b*值見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源花椒顏色L*、a*、b*值Table 2 L*，a*，b* values of Zanthoxylum bungeanum from different sources

a*值與花椒的紅色程度密切相關(guān)，漢源和武都的a*值平均值相對(duì)較高，分別是14.29，13.91，表明以上2種花椒的顏色在10種不同來(lái)源的花椒中更紅，與肉眼觀察的經(jīng)驗(yàn)鑒別結(jié)果一致。10種不同來(lái)源花椒的L*值范圍為37.83～42.51，b*值范圍為4.49～14.19，均具有較大差異。

2.2 花椒色素類成分測(cè)定

2.2.1 黃酮類成分含量測(cè)定

采用改進(jìn)的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[19]測(cè)定。精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于20 mL干凈試管中，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10% Al(NO)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%氫氧化鈉試液10 mL，用乙醇補(bǔ)至20 mL，搖勻，放置15 min，在波長(zhǎng)508 nm處以第一管為空白測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=10.729x-0.0089(R2=0. 9992)，線性范圍為0.01～0.05 mg/mL。各稱取1 g不同來(lái)源的花椒粉末(過(guò)40目篩)，加入30 mL 60%乙醇中，超聲0.5 h，離心，得到樣品液。精密移取0.2 mL樣品液于20 mL的干凈試管中，以60%乙醇做空白對(duì)照，按照上述操作顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度和黃酮含量。由表3可知，黃酮含量以漢源花椒最高(179.62 mg/g)，康美藥業(yè)有限公司最低(114.30 mg/g)。

表3 不同來(lái)源花椒色素類成分含量Table 3 Pigments content of Zanthoxylum bungeanum from different sources

由表3可知，葉綠素含量以安徽亳州藥材市場(chǎng)花椒最高(127.84 μg/g)，武都花椒最低(38.79 μg/g)。

2.2.2 多酚類成分含量測(cè)定

采用改進(jìn)的福林酚試劑比色法測(cè)定[20]。精密吸取0.00，0.25，0.5，0.75，1.00，1.25 mL的0.1 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶中，加入2 mol/L福林酚試劑4 mL，混勻，靜置4 min，加入10% NaCO38 mL，混勻，超純水定容至刻度，放置顯色2 h，在765 nm處以第一管為空白測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.1305x-0.0013(R2=0.9993)，線性范圍為1～5 μg/mL。稱取1 g花椒粉末(過(guò)40目篩)于30 mL 60%乙醇中，超聲0.5 h，離心，得到樣品液。吸取0.05 mL分別置于25 mL試管中，以60%乙醇做空白對(duì)照，按照上述操作顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度和多酚含量。由表3可知，多酚含量以漢源花椒最高(56.74 mg/g)，康美藥業(yè)有限公司花椒最低(34.75 mg/g)。

2.2.3 花青素含量測(cè)定

采用改進(jìn)的比色法進(jìn)行測(cè)定[21]。精密吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL的10 μg/mL花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL容量瓶中，0.1%鹽酸甲醇溶液定容，在520 nm處以0.1%鹽酸甲醇為空白測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.0674x-0.0045(R2=0.9993)，線性范圍為2～10 μg/mL。稱取1 g花椒粉末(過(guò)40目篩)于30 mL 0.1%酸性甲醇中，超聲0.5 h，離心得到樣品液，按照上述操作測(cè)定吸收度，計(jì)算樣品濃度和花青素含量。由表3可知，花青素含量以漢源花椒最高(112.89 μg/g)，亳州藥材市場(chǎng)含量最低(49.15 μg/g)。

2.2.4 葉綠素含量測(cè)定

參考孫俊寶等[22]的葉綠素含量測(cè)定方法，稱取1 g花椒粉末(過(guò)40目篩)于研缽中，加入10 mL 80%丙酮和無(wú)水乙醇(1∶1)，暗處?kù)o置12 h，離心，取適量上清液分別在645，663 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算葉綠素含量，見(jiàn)表3。計(jì)算公式如下：

葉綠素的總含量(μg/g)=(20.29A645+8.04A663)V/W。

式中：A645和A663分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光度值，V為提取液的體積(mL)，W為花椒樣品質(zhì)量(g)。

2.3 相關(guān)性分析

使用SPSS 20.0分別將花椒的顏色CIE L*、a*、b*值與花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，見(jiàn)表4?；ń返狞S酮、多酚和花青素含量與L*值呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.693，-0.765，-0.753；三者與顏色值a*呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.771，0.721，0.880，說(shuō)明在一定程度上L*值越小，a*值越大，花椒中總黃酮、多酚和花青素的含量越高; 而葉綠素與a*值呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.861，且與b*值呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.888,說(shuō)明在一定程度上a*值越小，b*值越大，花椒中葉綠素的含量越高;花青素的含量與顏色值b*也呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.700，說(shuō)明在一定程度上b*值越大，花青素含量越低。相關(guān)性分析結(jié)果表明，花椒的顏色CIE L*、a*、b*值與花椒中4種色素類成分含量存在著一定相關(guān)性，由機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)得到的顏色值在一定程度上能夠反映花椒中色素類成分的含量。

表4 花椒顏色值與色素類成分含量相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of color value and pigments content of Zanthoxylum bungeanum

注：“*”表示顯著，“**”表示極顯著。

2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(ANN)由輸入層、隱藏層和輸出層構(gòu)成，每一層均包含若干個(gè)神經(jīng)細(xì)胞。隱藏層的數(shù)量無(wú)限制，一個(gè)隱藏層基本具備接近預(yù)測(cè)結(jié)果和非線性函數(shù)的能力[23,24]。在人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，本研究采用matlab工具箱預(yù)測(cè)花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量。在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入層具有3個(gè)神經(jīng)元，分別代表花椒顏色特征的3個(gè)顏色指標(biāo)L*、a*、b*值。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出層具有4個(gè)神經(jīng)元，分別代表花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量。本試驗(yàn)采用反向傳播算法(BP)對(duì)人工神經(jīng)模型進(jìn)行訓(xùn)練，在輸入人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型前，需要將輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，數(shù)值從0～1不等；此外，我們分別采用Tangent-sigmoid和Log-sigmoid傳遞函數(shù)在隱藏層和輸出層中進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸；采用Levenberg-Marquardt(LM)算法使誤差最小化。

隱藏層中神經(jīng)元的數(shù)量是影響人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。為確定隱藏層神經(jīng)元的最優(yōu)數(shù)量，我們以最小標(biāo)準(zhǔn)誤差(RMSE)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用試錯(cuò)法依次計(jì)算了1～10個(gè)隱藏層神經(jīng)元所對(duì)應(yīng)的RMSE。60個(gè)花椒樣本中，70%的花椒隨機(jī)樣本用于訓(xùn)練模型，15%的花椒隨機(jī)樣本用于數(shù)據(jù)驗(yàn)證，15%的花椒隨機(jī)樣本用于測(cè)試?；ń伏S酮、多酚、花青素和葉綠素的訓(xùn)練集、驗(yàn)證集以及測(cè)試集不同隱藏層神經(jīng)元數(shù)量的平均RMSE見(jiàn)表5。

表5花椒色素類成分不同隱藏層神經(jīng)元數(shù)量的RMSE值比較

Table 5 Root mean square error value of different number of nodes in the hidden layer for pigments of Zanthoxylum bungeanum

由表5可知，花椒的黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)模型中隱藏層神經(jīng)元最優(yōu)數(shù)量分別是5，5，9，6，其對(duì)應(yīng)的RMSE分別為2.02±0.08，1.27±0.30，1.24±0.12，2.41±1.03。

花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性見(jiàn)圖3。

圖3 花椒色素類成分實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between the predicted values and experimental values of pigments content

由圖3可知，花椒黃酮實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.9881；多酚實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.8797；花青素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.9842；葉綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.9854；說(shuō)明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于機(jī)器視覺(jué)得出的顏色值在一定程度上能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素的含量，機(jī)器視覺(jué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可作為花椒色素類成分快速無(wú)損檢測(cè)的一種新方法與手段。

3 討論

花椒外觀品質(zhì)的三大評(píng)價(jià)指標(biāo)為“色”、“香”、“味”，其對(duì)應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)分別是花椒中的色素、揮發(fā)油和酰胺類成分，目前花椒的相關(guān)文獻(xiàn)研究以揮發(fā)油和酰胺類成分為主?；ń返狞S酮、多酚、花青素和葉綠素為天然性色素，性質(zhì)較為穩(wěn)定，均具有多種藥理活性。因此，花椒中色素類成分的測(cè)定可作為花椒品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

花椒外觀顏色的經(jīng)驗(yàn)鑒別描述受主觀影響較大，缺乏客觀性與準(zhǔn)確性，通過(guò)機(jī)器視覺(jué)將花椒外觀顏色數(shù)字化，得到顏色的客觀量化值，避免了個(gè)體差異對(duì)花椒顏色描述的影響，可達(dá)到快速、精確測(cè)定花椒顏色的目的。因此，通過(guò)機(jī)器視覺(jué)技術(shù)將花椒顏色客觀量化，能夠用于其色素類成分含量的預(yù)測(cè)。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以機(jī)器視覺(jué)系統(tǒng)獲得的花椒顏色值作為輸入值，以花椒中黃酮、多酚、花青素和葉綠素含量為輸出值，通過(guò)分析顏色值與色素類成分含量間的相關(guān)性并反復(fù)訓(xùn)練，建立了能夠通過(guò)顏色值預(yù)測(cè)各色素類成分含量的數(shù)據(jù)模型。因此，機(jī)器視覺(jué)-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)用技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)花椒色素類成分的快速無(wú)損檢測(cè)，解決了傳統(tǒng)分析方法測(cè)定色素類成分耗時(shí)多、試劑消耗大、不便利等缺點(diǎn)，可作為花椒品質(zhì)快速評(píng)價(jià)的一種新方法。但本次研究樣本量仍偏小，后期還應(yīng)增加樣本量，以提高預(yù)測(cè)的精確度與準(zhǔn)確度。