唐潤(rùn)梅，熊犍，崔春*，王煒，鄭雪君

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641 2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000)

酵母細(xì)胞壁是啤酒酵母或面包酵母生產(chǎn)酵母抽提物后得到的主要副產(chǎn)物。酵母細(xì)胞壁的外層主要是甘露聚糖，中間層主要是蛋白質(zhì)，內(nèi)層主要是葡聚糖[1]。甘露聚糖又稱甘露聚糖蛋白，對(duì)維護(hù)人體腸道的正常環(huán)境，抗氧化，延緩衰老，降血脂，降血壓，促進(jìn)機(jī)體免疫等方面具有明顯的作用[2-4]。不溶性酵母葡聚糖是以β-1,6糖苷鍵分支以β-1,3糖苷鍵連接的長(zhǎng)鏈多糖，對(duì)維持細(xì)胞壁形狀和硬度具有重要作用，在細(xì)胞壁中扮演著骨架多糖的角色，這類多糖具有增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的免疫活力，修復(fù)細(xì)胞，抗輻射，清除游離基，抗氧化，抗腫瘤，抗炎，抗菌，降血糖，調(diào)節(jié)血脂，降低膽固醇等作用[5-11]，還可作為酸奶增稠劑[12]，影響面團(tuán)的流變學(xué)行為[13]，作為藥物緩釋的基質(zhì)[14]。目前酵母細(xì)胞壁主要用于生產(chǎn)酵母葡聚糖，主要的提取工藝有：酸法、堿法、酸堿綜合法以及酶解法[15-24]，國(guó)內(nèi)以堿法提取為主。但是堿法提取酵母葡聚糖需用到大量氫氧化鈉，廢水量處理量大，環(huán)境壓力大。因此，本文探討了酶法提取酵母細(xì)胞壁的工藝，并對(duì)主要副產(chǎn)物進(jìn)行了分析，以期為我國(guó)酵母工業(yè)深加工提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酵母細(xì)胞壁 湖北安琪酵母有限公司；氫氧化鈉(分析純) 福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；硫酸(分析純)、鹽酸(分析純) 廣州化學(xué)試劑廠；冰乙酸(分析純) 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；硼酸(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；蒽酮(分析純) 上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水葡萄糖(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Savinase Ultra 16L 北京諾維信酶制劑公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純) 美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-3E數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCIENTZ-18冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；UV765型紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器有限公司；Sartotius BP211D分析天平 中科院廣州化學(xué)研究院；HYP-308消化爐、KND-103F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器 金壇市華城開(kāi)元實(shí)驗(yàn)儀器廠；磁力攪拌器 國(guó)華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SH220石墨消解儀 廣州海能儀器有限公司；A300氨基酸分析儀 德國(guó)曼默博爾公司。

1.2 酵母葡聚糖提取工藝

1.2.1 堿法制備酵母葡聚糖

酵母細(xì)胞壁200 g，氫氧化鈉120 g，懸浮于3680 mL蒸餾水中，升溫至95 ℃，保溫2 h后，加500 mL水降溫至40 ℃，離心棄上清液，再水洗2次，用硫酸調(diào)pH至4.5，離心棄上清液，再水洗3次稀釋至4 L，升溫至75 ℃，保溫30 min，離心棄上清液，再水洗至上清液透明，沉淀冷凍干燥后過(guò)100目篩包裝，見(jiàn)圖1。

1.2.2 酶解法制備酵母葡聚糖

酵母細(xì)胞壁130 g，懸浮于880 mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.0，125 ℃保溫5 h后，加730 mL蒸餾水冷卻至45 ℃，離心3次，收集上清液，沉淀稀釋至1 L，調(diào)pH至10.5，在45 ℃，t=0，1.5，3 h條件下，分別加入Savinase酶0.75 mL，5 h后，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，離心3次，收集上清液，沉淀冷凍干燥后過(guò)100目篩，用450 mL乙醇在75 ℃下攪拌2 h，過(guò)濾，濾渣分別用70 mL乙醇洗滌2次，干燥后包裝，見(jiàn)圖1。

圖1 堿提法和酶解法提取酵母葡聚糖的工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram of yeast glucan extraction by alkali extraction and enzymatic hydrolysis

1.3 檢測(cè)與分析方法

1.3.1 總糖含量測(cè)定

采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定產(chǎn)品中的總糖含量。

1.3.2 灰分測(cè)定

參照GB/T 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.3 水分含量測(cè)定

直接干燥法，參照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》。

1.3.4 粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定

凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.5 粗脂肪含量測(cè)定

酸水解法，參照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》。

1.3.6 氨氮含量測(cè)定

甲醛值法，參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定。

1.3.7 氨基酸組成分析

根據(jù)Waters公司提供的方法，游離氨基酸樣品前處理使用磺基水楊酸法。氨基酸檢測(cè)條件：4 mL樣品與1 mL 15%的磺基水楊酸溶液混合沉淀樣品中大分子的蛋白和多肽，4 ℃下反應(yīng)1 h，10000 r/min離心15 min。過(guò)濾，樣品經(jīng)過(guò)微濾膜(0.22 μmol)處理。用液相離子交換柱(分離柱TS263，MembraPure)分離氨基酸，茚三酮顯色，流速為60 μL/min，除脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm外，其余均在570 nm處檢測(cè)。各氨基酸濃度采用外標(biāo)法計(jì)算。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)分析

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 16291.1-2012的方法進(jìn)行篩選和培訓(xùn)感官分析評(píng)價(jià)員，品評(píng)小組包括3名男生和3名女生(年齡在23～30歲)。培訓(xùn)前，配制5種滋味的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別是氯化鈉溶液(咸味，0.7%)、谷氨酸鈉溶液(鮮味，0.35%)、蔗糖溶液(甜味，1%)、檸檬酸(酸味，0.08%)、L-異亮氨酸(苦味，0.5%)。培訓(xùn)期間，對(duì)一系列不同種類的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行感官品評(píng)，口頭交流定量描述分析具體細(xì)則。所有評(píng)價(jià)員都在定量描述分析方法及程度上得到一致意見(jiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種工藝提取酵母葡聚糖對(duì)比

目前，已有不少關(guān)于酵母葡聚糖的分離純化研究以及功能性研究，歐盟及我國(guó)也都有關(guān)于酵母葡聚糖的規(guī)定，見(jiàn)表1。酵母葡聚糖主要的提取工藝有：酸提法、堿提法、酸堿綜合法以及酶解法，我國(guó)普遍采用堿提法制備酵母葡聚糖。本實(shí)驗(yàn)比較了堿提法和酶解法工藝，獲得的酵母葡聚糖產(chǎn)量和組成見(jiàn)表2。酶解法工藝基本不用堿，相比于堿提法提取1 kg原料酵母細(xì)胞壁用水50.0 L，酶解法提取1 kg原料用水26.9 L，用水量也較低，且酶解法提取得率(31.5%)較堿法提取得率(27.5%)高(見(jiàn)表2)。堿性條件會(huì)導(dǎo)致葡萄糖鏈部分降解，而酶解法條件溫和，對(duì)環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)較小，且能夠保持葡聚糖的天然結(jié)構(gòu)，對(duì)產(chǎn)物造成的降解較小。

表1 中國(guó)及歐盟對(duì)酵母葡聚糖的規(guī)定Table 1 Regulations of Chinese and EU on yeast glucan %

表2 堿提法和酶解法方法比較和酵母葡聚糖產(chǎn)品理化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of alkali extraction method and enzymatic method and comparison of physical and chemical indicators of yeast glucan products

2.2 酶解法各步驟副產(chǎn)物收集及分析

酶解法提取工藝條件溫和，并且有3個(gè)步驟會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，且可以進(jìn)一步富集。1 kg原料酵母細(xì)胞壁經(jīng)過(guò)高熱水提后收集的上清液富含可溶性蛋白和可溶性糖，如甘露聚糖，又稱甘露聚糖蛋白，對(duì)維護(hù)人體腸道的正常環(huán)境，抗氧化，延緩衰老，降血脂，降血壓，促進(jìn)機(jī)體免疫等方面具有明顯的作用，經(jīng)真空冷凍干燥得到一種淺褐色粉末，即為副產(chǎn)物1。酶解后離心上清液富含小分子肽，經(jīng)真空冷凍干燥得到一種深褐色粉末，即為副產(chǎn)物2。乙醇洗滌后的濾液經(jīng)揮發(fā)得到一種褐色油，即為副產(chǎn)物3，它們的產(chǎn)量和組成見(jiàn)表3。

表3 酶解法制備酵母葡聚糖的副產(chǎn)物分析Table 3 Analysis of yeast glucan by-products prepared by enzymatic hydrolysis method

2.2.1 酶解法的副產(chǎn)物2呈味效果分析

酶解法的副產(chǎn)物2的感官評(píng)價(jià)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶解法的副產(chǎn)物2的感官評(píng)價(jià)分析Fig.2 Sensory evaluation analysis of by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

由圖2可知，得分最高的是鮮味，達(dá)到了4.2，之后分別為咸味(3.5)、苦味(1.5)、酸味(1)，甜味得分最低，僅有0.5。該結(jié)果說(shuō)明酶解法的副產(chǎn)物2具有較為明顯的鮮味作用，故對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行了氨基酸組成分析。

2.2.2 酶解法的副產(chǎn)物2氨基酸組成分析

在食品風(fēng)味的形成過(guò)程中，氨基酸不僅提供其自有滋味，還與其他滋味物質(zhì)協(xié)同作用[25]，為研究各游離氨基酸對(duì)酶解法的副產(chǎn)物2的貢獻(xiàn)，對(duì)酶解法的副產(chǎn)物2的總氨基酸含量和各游離氨基酸(free amino acid，F(xiàn)AA)的含量進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 酶解法的副產(chǎn)物2的氨基酸組成及 游離氨基酸呈味特性、呈味閾值Table 4 The amino acid composition and the taste characteristics and taste threshold of FAAs in the by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

由表4可知，副產(chǎn)物2的游離氨基酸總量為411.2 mg/kg，其中含量較高的依次為：半胱氨酸(72.3 mg/kg)、組氨酸(60.2 mg/kg)、丙氨酸(40.6 mg/kg)、亮氨酸(34.4 mg/kg)、精氨酸(25.0 mg/kg)和蘇氨酸(22.6 mg/kg)，但其含量遠(yuǎn)低于其呈味閾值。人們對(duì)味道的感知是由其中呈味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及呈味閾值共同決定的，即呈味強(qiáng)度值(taste activity value，TAV)。根據(jù)表中各游離氨基酸的含量及其呈味閾值，分析得到各游離氨基酸在酶解后離心上清液中的呈味強(qiáng)度值，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，酶解后離心上清液中各已知刺激閾值的游離氨基酸按呈味強(qiáng)度的大小排序依次是：組氨酸(0.301)>丙氨酸(0.068)>谷氨酸(0.062)>精氨酸(0.05)>賴氨酸(0.036)>天冬氨酸(0.022)，其他較低。谷氨酸和天冬氨酸是常見(jiàn)的呈鮮味氨基酸，谷氨酸具有最強(qiáng)的鮮味，圖3中谷氨酸的呈味強(qiáng)度值(0.062)較高，與圖2中酶解法的副產(chǎn)物2的感官評(píng)價(jià)分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。雖然也有檢測(cè)到具有苦味的呈味氨基酸如苯丙氨酸等，但是其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于呈味閾值，有研究認(rèn)為，微量的苦味物質(zhì)會(huì)與其他類呈味物質(zhì)協(xié)同作用，例如，對(duì)鮮味有一定的促進(jìn)作用[26]。因此，本文認(rèn)為組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和天冬氨酸是副產(chǎn)物2滋味的主要來(lái)源。

圖3 酶解法的副產(chǎn)物2的游離氨基酸的呈味強(qiáng)度比較Fig.3 Comparison of TAV of FAAs in the by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

3 結(jié)論

與堿提法相比，酶解法提取酵母葡聚糖的得率較高，用水量與用堿量較低，對(duì)環(huán)境造成的壓力小，且條件溫和，對(duì)產(chǎn)物造成的降解小。酶解法提取過(guò)程副產(chǎn)物可以富集，高熱水提后收集上清液經(jīng)真空冷凍干燥可得到甘露聚糖。酶解后離心上清液富含小分子肽，經(jīng)真空冷凍干燥得到一種深褐色粉末，游離氨基酸總量為411.2 mg/kg，對(duì)滋味的貢獻(xiàn)大小排序依次是：組氨酸>丙氨酸>谷氨酸>精氨酸>賴氨酸>天冬氨酸。