張書泰，周斌，童星，周其洋*

(1.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528500；2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528500)

醬油起源于中國(guó)，至今已有2500年的歷史，在中國(guó)、日本、韓國(guó)及東南亞國(guó)家作為一種重要的食品調(diào)味品[1,2]。醬油釀造最重要的兩個(gè)工藝環(huán)節(jié)是制曲和醬醪發(fā)酵[3,4]。其中，制曲階段主要是以曲霉(如米曲霉、醬油曲霉)代謝活動(dòng)為中心進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，生成的物質(zhì)是構(gòu)成醬油風(fēng)味的源泉[5,6]；醬醪發(fā)酵主要是以耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為主進(jìn)行液體發(fā)酵，在這個(gè)階段生成大量的乙醇、甘油和醇類物質(zhì)以及芳香族化合物，賦予醬油特殊的風(fēng)味[7-9]。在醬油發(fā)酵過程中，微生物對(duì)醬油色、香、味和體態(tài)的形成和品質(zhì)起到了極其重要的作用[10,11]。

自20世紀(jì)60年代開始，研究者開始對(duì)醬油發(fā)酵過程中的微生物多樣性進(jìn)行研究，研究方法主要是傳統(tǒng)的平板分離培養(yǎng)技術(shù)[12]。后續(xù)隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，使微生物多樣性的研究方法不再局限于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，運(yùn)用非培養(yǎng)的生理生化方法和分子生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境中89%～99%不可培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物的檢測(cè)，對(duì)微生物進(jìn)行更全面而深入的了解[13]。本文介紹了研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性的多種方法，簡(jiǎn)要地綜述了各技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用概況，以期為研究醬油釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成、演替和功能代謝及其對(duì)醬油風(fēng)味的形成機(jī)理和對(duì)醬油品質(zhì)的影響開拓新思路。

1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法根據(jù)目標(biāo)微生物對(duì)不同碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)比例的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)行定時(shí)定溫培養(yǎng)，然后通過形態(tài)觀察，并結(jié)合生理生化特征等進(jìn)行鑒定，分析不同可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量。Tanaka等、Wei等[14]和Yan等[15]利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)醬油和日本醬油發(fā)酵過程中微生物變化分析得出，醬油制曲階段中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌群，其次為酵母菌和霉菌；醬醪發(fā)酵中雖然乳酸菌仍為優(yōu)勢(shì)菌群，但數(shù)量與制曲階段相比降低了3～5倍。Cui等[16]研究發(fā)現(xiàn)醬油發(fā)酵整個(gè)階段中，乳酸菌、酵母菌和霉菌總微生物數(shù)量在春季最高，夏季最低；其中，乳酸菌和酵母菌數(shù)量變化與總微生物變化趨勢(shì)相一致；而霉菌在冬季數(shù)量最多，夏季數(shù)量變化最大。Tanasupawat等[17]利用微生物培養(yǎng)方法對(duì)泰國(guó)醬油醬醪中的乳酸菌數(shù)量和種類進(jìn)行了分析，共分離純化得到44株乳酸菌，其中以Lactobacillusacidipisis和Tetragenococcushalophilus為主，其次為L(zhǎng)actobacilluspentosus，Lactobacillusplantarum和Lactobacillusfarciminis；同時(shí)，結(jié)合生理生化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)Lactobacilluspentosus可利用D-glucose產(chǎn)生DL-lactic，Lactobacillusplantarum細(xì)胞內(nèi)含2,6-二氨基庚二酸，Lactobacillusfarciminis為異型發(fā)酵乳酸菌。這些研究揭示了醬油醬醪發(fā)酵中乳酸菌群落的結(jié)構(gòu)和功能，為醬油發(fā)酵中乳酸菌的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法有利于了解分離純化得到的微生物的形態(tài)特征和生理特性，對(duì)有價(jià)值的微生物進(jìn)行保藏、應(yīng)用等，但該方法在實(shí)際應(yīng)用中工作量大、流程繁瑣，且人工模擬的環(huán)境與醬油發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)環(huán)境存在一定偏差，不能準(zhǔn)確反映微生物群落組成、分布及變化特征[18-20]。

2 磷脂脂肪酸(PLFA)分析法

不同的微生物細(xì)胞膜中含有不同種類和數(shù)量的磷脂脂肪酸，通過提取微生物細(xì)胞內(nèi)的磷脂脂肪酸，利用氣相、氣質(zhì)聯(lián)用等色譜技術(shù)測(cè)定其種類和含量并進(jìn)行分類鑒定。目前，該方法多用于土壤微生物的研究，在醬油發(fā)酵過程中微生物多樣性的研究中運(yùn)用較少，在白酒大曲、酸菜中有較多報(bào)道[21-24]。趙金松等采用PLFA技術(shù)分析了清香型大曲、濃香型大曲和醬香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，結(jié)果表明不同類型的大曲微生物都以真菌(18：2ω6，9、18：1ω9)為優(yōu)勢(shì)菌群，占脂肪酸總量的90%以上；細(xì)菌以G+(a14：0、i14：0、i15：0、a16:0、i16:0)為主；不同工藝大曲微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，隨制曲溫度升高，大曲微生物多樣性降低。Wu等利用PLFA分析了Lactobacillusplantarum和Zygosaccharomycesrouxii對(duì)中國(guó)酸菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及酸菜風(fēng)味形成的影響，檢測(cè)到酸菜發(fā)酵過程中微生物以G+(a14：0、i16:0)和真菌(18：2ω6，9、18：1ω9)為優(yōu)勢(shì)菌群。Zhang等[25]運(yùn)用PLFA方法對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油不同發(fā)酵模式下醬醪發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，包括高鹽稀態(tài)發(fā)酵(HSDS)和低鹽液態(tài)發(fā)酵(LSSS)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明醬醪發(fā)酵中以G+((a14：0、i15：0、a15：0、a16:0、i16:0))和真菌(18：2ω9，11、18：1ω9、18：3ω9，12，15)為優(yōu)勢(shì)菌群；發(fā)酵期間，HSDS醬醪真菌生物量高于LSSS醬醪，且在發(fā)酵中期(60天)生物量達(dá)到最大，之后降低。

由于某些磷脂脂肪酸在不同微生物類群中都有存在，造成不同微生物類群的磷脂脂肪酸出現(xiàn)重疊；且磷脂脂肪酸含量也會(huì)受到不同因素的影響而發(fā)生改變，比如溫度、pH值等；同時(shí)，微生物細(xì)胞內(nèi)的磷脂脂肪酸也會(huì)隨著生長(zhǎng)期變化而發(fā)生變化[26,27]。因此，磷脂脂肪酸分析法適用于對(duì)微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)分析，但不適用于微生物群落種群分析。

3 分子生物學(xué)方法

隨著DNA提取技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于微生態(tài)學(xué)的研究，為發(fā)酵食品微生物群落多樣性的研究帶來了良好的契機(jī)[28,29]。

分子生物學(xué)以核糖體基因序列(rRNA)為研究對(duì)象，16S rRNA基因具有高度的保守性和高變異性，保守性能夠反映生物物種的親緣關(guān)系，高變異性則能反映生物物種特征核酸序列的差異性，以及擁有豐富的數(shù)據(jù)庫等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于原核微生物多樣性研究[30-32]。真核微生物多樣性研究主要基于18S rRNA基因、26S rRNA基因或5.8S rDNA間隔區(qū)的分析(ITS間隔區(qū))的擴(kuò)增和分析[33-36]。

3.1 基因指紋圖譜分析法

基因指紋圖譜技術(shù)是基于核酸分子成分、大小和構(gòu)型上的差異，利用電泳方法將不同的核酸分子分離，形成不同分子量的基因條帶圖譜，根據(jù)圖譜上條帶信息進(jìn)行基因分析的技術(shù)。基因條帶圖譜中，每個(gè)條帶代表不同的操作分類單位(Operational Taxonomy Unit，OTU)，條帶數(shù)量反映微生物種群的多樣性和相對(duì)豐度。目前，基因指紋圖譜技術(shù)在發(fā)酵食品中應(yīng)用較廣泛，有以下幾種類型。

3.1.1 DNA長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜分析

DNA長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜分析法是基于DNA長(zhǎng)度多態(tài)性的研究方法，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)分析法、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析法(Amplified Ribosoma DNA Restriction Analysis，ARDRA)、末端限制片段多態(tài)性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)技術(shù)。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP)是根據(jù)不同微生物種群基因限制性片段長(zhǎng)度的差異，先將基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，經(jīng)電泳分離形成長(zhǎng)度多態(tài)圖譜，再根據(jù)圖譜條帶分子量大小和數(shù)量分析微生物群落結(jié)構(gòu)和組成[37]。末端限制片段多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)和擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析法(ARDRA)是在RFLP基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。末端限制片段多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)是在其中一個(gè)PCR擴(kuò)增引物5'末端上加上熒光標(biāo)記，將基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行電泳分離，分析其帶熒光標(biāo)記的末端限制性片段多樣性。擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析法(ARDRA)是對(duì)擴(kuò)增后的16S rDNA進(jìn)行限制性酶消化，再根據(jù)電泳分離得到的多態(tài)圖譜分析微生物群落結(jié)構(gòu)、組成。王彩虹[38]采用RFLP技術(shù)建立了汾酒清香型大曲、瀘州老窖濃香型大曲和郎酒醬香型大曲細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，比較了不同類型大曲細(xì)菌和真菌多樣性；研究發(fā)現(xiàn)隨著制曲品溫的升高，耐溫性芽孢桿菌、高溫放線菌、嗜熱或耐熱霉菌比例也增加，同時(shí)也檢測(cè)到了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未檢測(cè)到的微生物，如枝芽孢桿菌(Virgibacillus)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、掃帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)等。李艷等[39]從羊羔美酒大曲中分離出14種不同形態(tài)類型的酵母共474株，采用ITS-RFLP分析酵母菌多樣性，經(jīng)基因序列發(fā)現(xiàn)14株不同形態(tài)的酵母分屬于6個(gè)屬的6種酵母菌，其中以釀酒酵母為優(yōu)勢(shì)菌群。但是，RFLP、T-RFLP和ARDRA技術(shù)都存在一定的缺陷：操作繁瑣，對(duì)操作人員技術(shù)和儀器檢測(cè)精度要求高，以及圖譜中的每個(gè)條帶不一定對(duì)應(yīng)一個(gè)菌種，影響微生物群落多樣性的評(píng)估[40]。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)是以非限制性的隨機(jī)核苷酸為引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，根據(jù)圖譜分析微生物基因組多態(tài)性。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)整個(gè)未知的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析，在物種分類和鑒定上應(yīng)用較廣泛[41,42]。但是，由于引物篩選過于繁瑣，且隨機(jī)引物擴(kuò)增的條帶過于復(fù)雜，不易分析。

3.1.2 DNA成分多態(tài)性分析

DNA成分多態(tài)性分析是利用雙鏈DNA在變性劑梯度或者溫度梯度下，部分解鏈形成單鏈DNA在聚丙烯酰胺變性凝膠上的遷移速率隨解鏈程度的增大而減小，形成不同序列的DNA圖譜條帶。DNA成分多態(tài)性圖譜分析技術(shù)包括時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TTGE)、溫度梯度凝膠電泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE)和變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)。DGGE已成為研究發(fā)酵食品微生物多樣性最常用的手段之一，也是醬油釀造過程中微生物多樣性的研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，表1展示了部分近些年DGGE技術(shù)在醬油釀造過程中微生物多樣性研究的概況。利用DGGE對(duì)醬油釀造過程中微生物多樣性的研究結(jié)果表明，醬油制曲過程中微生物多樣性程度較高，細(xì)菌主要以Weissellasp.，Staphylococcussp.，Bacillussp.，Lactobacillussp.為優(yōu)勢(shì)菌群，真菌以Aspergillus，Candida，Trichosporonasahii，Pichia等為優(yōu)勢(shì)菌群[43]。醬油發(fā)酵過程中，主要優(yōu)勢(shì)微生物由制曲期間不耐鹽性和不耐酸性微生物演替成鹽水落黃發(fā)酵之后的耐鹽性和耐酸性微生物。其中細(xì)菌主要有：Weissellasp.，Staphylococcussp.，Lactobacillusfermentum，L.plantarum，Tetragenococcushalophilus[44]。真菌主要有：Zygosaccharomycesrouxii，Candidaetchellsii，Candidaversatilis，Rhodotorulasp.等。另外，還檢測(cè)到部分不可培養(yǎng)的微生物，如uncultured yeast。DGGE和TGGE檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性都很高，能夠分離出1 bp堿基差異的DNA片段。但是，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，由于部分微生物存在異源雙鏈現(xiàn)象和對(duì)相似度近的微生物檢測(cè)性差異等因素，無法對(duì)微生物進(jìn)行定量分析。

表1 部分DGGE技術(shù)在醬油釀造過程中微生物多樣性研究概況Table 1 Research status of microbial diversity in soy sauce brewing process by DGGE technology

續(xù) 表

3.2 宏基因組學(xué)

宏基因組是1998年Handelsman首次提出，將宏基因組定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和[45,46]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)被廣泛應(yīng)用于自然環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)(如土壤、海洋等)、人體和動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[47-52]。表2列舉了近幾年部分與食品微生物相關(guān)的宏基因組學(xué)研究，主要應(yīng)用在奶制品、泡菜、普洱茶等發(fā)酵食品研究中。分析方法包括利用細(xì)菌和古細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA、28S rDNA和ITS分析食品微生物多樣性及對(duì)食品微生物宏基因進(jìn)行測(cè)序，分析其群落功能和代謝途徑[53,54]。目前，宏基因組學(xué)在醬油釀造微生物的研究中應(yīng)用較少，本文簡(jiǎn)要介了宏基因組學(xué)在其他發(fā)酵食品中的應(yīng)用進(jìn)展，以供利用宏基因組學(xué)分析醬油釀造微生物研究做參考依據(jù)。

表2 部分與食品微生物相關(guān)的宏基因組學(xué)研究Table 2 Some metagenomic researches related to food microorganisms

續(xù) 表

注：項(xiàng)目信息由MG-RAST(http://metagenomics.anl.gov/)搜索獲得。

3.2.1 宏基因組學(xué)技術(shù)基本方法

3.2.1.1 提取總基因組DNA

DNA的提取方法可分為兩種，即原位裂解法和間接提取法(細(xì)胞分離提取法，見圖1)。原位裂解法主要是通過酶解法、變性劑等方法直接從樣品中提取微生物總DNA，該方法操作簡(jiǎn)便，提取率高，但是提取的DNA片段小(1～50 kb)，適用于構(gòu)建小片段文庫的DNA提取。間接提取法是先用物理方法從樣品中分離微生物，然后采用溫和的方法提取微生物總DNA，該方法的操作較繁瑣，在分離微生物過程中可能造成部分微生物丟失，但是獲得的DNA片段大(20～500 kb)，且純度高，適用于構(gòu)建大片段文庫的DNA提取。

圖1 環(huán)境微生物宏基因組學(xué)研究方法Fig.1 Research methods for environmental microbial metagenomics

3.2.1.2 宏基因組文庫的構(gòu)建

根據(jù)插入片段大小，將總基因組DNA克隆到質(zhì)粒載體、柯斯載體、福斯載體或BAC載體中。再將克隆后的載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌，構(gòu)建基因組文庫，見圖1。

3.2.1.3 宏基因組文庫的篩選

由圖1可知，宏基因組文庫的篩選方法可分為：基于基因序列特異性差異的序列篩選法；基于基因活性的功能篩選法；基于底物誘導(dǎo)基因表達(dá)的篩選法[55]。

3.2.1.4 宏基因組學(xué)的分析

宏基因組學(xué)的分析方法主要是基于高通量測(cè)序技術(shù)和數(shù)據(jù)處理分析平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序和全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。其中，以對(duì)16S rDNA擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)序分析的方法最常用[56]。表3列舉了宏基因組學(xué)研究中部分常用的生物信息學(xué)平臺(tái)。通過數(shù)據(jù)處理分析平臺(tái)可以對(duì)序列進(jìn)行前處理和分析，包括序列去噪、質(zhì)量控制、序列拼接、分類學(xué)分析和序列功能預(yù)測(cè)等，進(jìn)而分析微生物群落組成、群落功能、遺傳多樣性、微生物代謝的相互作用及其與環(huán)境因素的相互關(guān)聯(lián)等[57-59]。

表3 常用的生物信息學(xué)平臺(tái)及其主要工具Table 3 Commonly used bioinformatics platforms and their main tools

續(xù) 表

3.2.2 宏基因組學(xué)在發(fā)酵食品微生物研究中的應(yīng)用

Almeida等[60]采用鳥槍法宏基因組學(xué)研究傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪微生物群落功能基因庫，實(shí)驗(yàn)分離出142株細(xì)菌?；诤昊蚪M序列分析，這些細(xì)菌分屬于67個(gè)屬、137個(gè)種，并構(gòu)建117個(gè)基因組草圖，使得奶酪中細(xì)菌基因組增加2倍，為乳制品微生物群落研究提供了更多的基因數(shù)據(jù)源。Chen等[61]利用宏基因組學(xué)分析中國(guó)甘肅漿水菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)組成，研究發(fā)現(xiàn)漿水菜中真菌分屬4個(gè)菌門、10個(gè)種。其中Candidaxylopsoci為優(yōu)勢(shì)菌群(占23.96%)，其次為Sporopachydermiasp.，Cystofilobasidiaceae等，以及大量的未鑒定的真菌序列(占44.44%)。這些研究結(jié)果揭示了漿水菜中微生物群落結(jié)構(gòu)組成，而大量的未鑒定菌群也暗示著漿水菜發(fā)酵過程中微生物多樣性豐富、代謝途徑復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。Lyu等[62]運(yùn)用宏基因組學(xué)分析普洱茶在渥堆發(fā)酵過程中微生物群落組成和群落功能，研究發(fā)現(xiàn)普洱茶在渥堆發(fā)酵中以細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，細(xì)菌以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主要菌群，真菌以子囊菌門(Ascomycota)為優(yōu)勢(shì)菌群。經(jīng)KEGG代謝途徑分析，與萜類、酮類及其他次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的69種酶基因分布于16種代謝途徑中，包括氨基酸代謝途徑、碳水化合物代謝途徑、核酸代謝途徑等。

傳統(tǒng)發(fā)酵醬油釀造過程微生物多樣性研究中，Wang等[63]利用宏基因組學(xué)分析中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油制曲到醬醪發(fā)酵過程細(xì)菌多樣性的變化，研究發(fā)現(xiàn)制曲階段細(xì)菌存在29個(gè)不同種屬，醬醪發(fā)酵階段有34個(gè)不同種屬。由制曲轉(zhuǎn)化至醬醪發(fā)酵有7個(gè)不同種屬的細(xì)菌消失，12個(gè)不同新種屬出現(xiàn)。Sulaiman等[64]運(yùn)用鳥槍法宏基因組學(xué)對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油為期6個(gè)月的醬醪發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及微生物功能進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Weissella在發(fā)酵初期為優(yōu)勢(shì)菌群，隨后Candida為優(yōu)勢(shì)菌群，整個(gè)發(fā)酵過程中酵母數(shù)量增加，真菌豐度降低；而細(xì)菌豐度在發(fā)酵過程中先降低，到第6個(gè)月則增加。通過宏基因組的代謝重建，揭示了醬油發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和碳水化合物異氧發(fā)酵的特征，與檢測(cè)到的發(fā)酵過程中乙醇含量和pH值下降情況相符合。其中，對(duì)編碼碳水化合物代謝途徑的基因進(jìn)行分析，包括三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))和磷酸戊糖途徑，發(fā)現(xiàn)從醬醪發(fā)酵第1個(gè)月開始代謝途徑由同型發(fā)酵轉(zhuǎn)為異型發(fā)酵，且與異型發(fā)酵乳酸菌相關(guān)性高。對(duì)編碼支鏈氨基酸基因進(jìn)行分析，包括異亮氨基酸、亮氨酸和纈氨酸，發(fā)現(xiàn)Candida可能通過Ehrlich途徑代謝支鏈氨基酸，在發(fā)酵過程中由支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶和乙醇脫氫酶作用產(chǎn)生芳香化合物。這些研究結(jié)果有助于我們更好地了解中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)、功能演替和潛在的代謝能力。

另外，發(fā)酵食品安全也是發(fā)酵食品工業(yè)中的一個(gè)重要研究方向，宏基因組學(xué)技術(shù)在分析發(fā)酵食品安全問題中也發(fā)揮著重要作用。Park等[65]運(yùn)用鳥槍法宏基因組學(xué)技術(shù)分析自然發(fā)酵的蝦、韓國(guó)泡菜和德國(guó)泡菜中的病毒種類，發(fā)現(xiàn)37%～50%的新序列，以雙螺旋DNA病毒Caudovirales為主，包括Myoviridae，Podoviridae和Siphoviridae。Jung等[66]運(yùn)用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究朝鮮泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌基因表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了大量噬菌體DNA序列。這些研究表明發(fā)酵食品中微生物種類和功能復(fù)雜，為發(fā)酵食品安全研究提供了更豐富的基因數(shù)據(jù)庫。但是，宏基因組學(xué)的研究及數(shù)據(jù)的分析很大程度依賴于現(xiàn)有微生物物種數(shù)據(jù)庫的豐富度，且生物信息分析對(duì)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)要求高，不同的算法對(duì)研究結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響，這限制了對(duì)微生物新品種和新功能基因的研究和開發(fā)利用。

4 展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們對(duì)醬油釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究不再受傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的限制。近幾年，基于細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA(或25S rDNA～28S rDNA)或rDNA間隔區(qū)的分析，不僅克服了純培養(yǎng)的限制，豐富了醬油釀造過程中微生物多樣性，也提高了分析效率。特別是高通量測(cè)序和宏基因組學(xué)技術(shù)的不斷革新，以及生物信息學(xué)工具和大數(shù)據(jù)處理平臺(tái)的完善，不僅更真實(shí)地反映了醬油發(fā)酵過程中微生物組成、分布及演替，也讓我們進(jìn)一步了解了醬油釀造過程中微生物代謝和功能演替。但是，每種微生物多樣性研究方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在研究工作中我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究目的，選擇合適的一種或結(jié)合幾種研究方法進(jìn)行研究，才能更有效地挖掘和利用微生物多樣性信息。

在未來的工作中，我們應(yīng)該考慮醬油工業(yè)生產(chǎn)中，醬油發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢(shì)微生物和醬油生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)環(huán)境之間的相互關(guān)系；了解醬油發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢(shì)微生物間的相互作用，探索如何通過微生物數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)醬油發(fā)酵過程中存在的工藝問題，為醬油生產(chǎn)工藝優(yōu)化和醬油質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。