高飛飛 馬彥

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，太原 030000)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種腐生的絲狀真菌，其營(yíng)養(yǎng)菌絲存在于土壤、空氣和有機(jī)物質(zhì)中，是免疫功能嚴(yán)重受損患者最常見的感染性死亡原因之一。煙曲霉細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，這種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)成為其對(duì)抗環(huán)境的主要防線[1]。由于支持煙曲霉生長(zhǎng)和繁殖的自然過程的變化或者所處環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)，其細(xì)胞壁會(huì)經(jīng)歷持續(xù)的生物合成和重塑[2]。研究發(fā)現(xiàn)，許多基因可通過改變細(xì)胞壁成分含量而使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重塑。煙曲霉分生孢子的形成也會(huì)伴隨著孢子細(xì)胞壁的重塑[3-4]。另外，相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子會(huì)控制細(xì)胞壁的生物合成，調(diào)節(jié)煙曲霉細(xì)胞壁的穩(wěn)態(tài)[5-6]。分生孢子發(fā)展形成菌絲的過程、基因的正確定位對(duì)煙曲霉的致病相當(dāng)關(guān)鍵[7]。抵抗宿主環(huán)境壓力的機(jī)械強(qiáng)度主要由其細(xì)胞壁提供，所以細(xì)胞壁的破壞對(duì)菌絲形態(tài)有深遠(yuǎn)的影響。鑒于煙曲霉細(xì)胞壁在真菌生理學(xué)中的重要作用，它被認(rèn)為是抗真菌藥物的一個(gè)極好的靶點(diǎn)。

1 參與細(xì)胞壁重塑的相關(guān)基因、蛋白

煙曲霉細(xì)胞壁90%以上為多糖，主要由β-(1，3)-葡聚糖、α-(1，3)-葡聚糖、半乳甘露聚糖、幾丁質(zhì)組成[1]。但是在煙曲霉不同形態(tài)中，其細(xì)胞壁成分還是有區(qū)別的。半乳糖氨基半乳聚糖在菌絲細(xì)胞壁中存在，而黑色素和疏水小棒狀蛋白在分生孢子細(xì)胞壁中存在[8]。

1.1 與細(xì)胞壁成分相關(guān)的基因、蛋白

β-(1，3)-葡聚糖 β-(1，3)-葡聚糖占多糖部分20%～35%，存在于線性分生孢子鏈的分生孢子連接處，由質(zhì)膜結(jié)合葡聚糖形成的酶復(fù)合物，同時(shí)使用UDP-葡萄糖作為底物，并通過質(zhì)膜將線性β-(1，3)-葡聚糖鏈擠出，進(jìn)入胞質(zhì)[8]。當(dāng)?shù)竭_(dá)胞質(zhì)時(shí)，線性β-(1，3)葡聚糖被重塑，與預(yù)先存在的細(xì)胞壁成分結(jié)合。β-(1，3)-葡聚糖延伸分支是煙曲霉細(xì)胞壁構(gòu)建過程中的重要步驟[9]。

①煙曲霉GH16家族β-(1，3)-葡聚糖酶是分生孢子細(xì)胞壁形成的必需酶。在煙曲霉中，只有Eng1p和Eng2p被鑒定為內(nèi)切β-(1，3)-葡聚糖酶，占總內(nèi)切β-(1，3)葡聚糖酶活性的十分之一。它可以裂解可溶性和不溶性β-(1，3)-葡聚糖，并可以直接作用于整個(gè)細(xì)胞壁中的β-(1，3)-葡聚糖聚合物，導(dǎo)致煙曲霉分生孢子細(xì)胞壁在延伸過程中β-(1，3)-葡聚糖含量減少，使分生孢子細(xì)胞壁發(fā)生重塑。且在β-(1，3)-葡聚糖酶的多重缺失突變體Δeng1,2在分生孢子膨脹期間顯示出異常形態(tài)，表明GH16家族β-(1，3)-葡聚糖酶對(duì)于其分生孢子細(xì)胞壁重塑有很大的作用[3]。其他的內(nèi)切β-(1，3)-葡聚糖酶家族成員(GEL家族,GH55、GH17糖基轉(zhuǎn)移酶)在分生孢子萌發(fā)過程中的細(xì)胞壁重塑也扮演著重要角色[10]。②GPI錨定的β-(1,3)-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶家族在煙曲霉細(xì)胞壁葡聚糖延伸過程中發(fā)揮了重要作用[11]。葡聚糖的延伸是通過β-(1，3)-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的作用進(jìn)行的。其中編輯β-(1,3)-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因rhoA主要作用是催化GPI錨合成，敲除該基因會(huì)導(dǎo)致GPI連接蛋白的缺失，使突變株孢子萌發(fā)提前,細(xì)胞自溶，細(xì)胞壁變厚，使β-(1，3)-葡聚糖含量增加。它在細(xì)胞壁中的重塑作用主要是通過潛在的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行的[12]。

幾丁質(zhì) 幾丁質(zhì)占細(xì)胞壁多糖成分的7%～15%，它是通過β-(1，4)-連接到β-(1，3)-葡聚糖的非還原端而形成的，乙?；潭仍?0%或50%以上的聚合物通常稱為幾丁質(zhì)，是煙曲霉細(xì)胞壁的少數(shù)成分[7]。

MADS-Box轉(zhuǎn)錄因子RlmA可調(diào)節(jié)MpkA磷酸化，是編碼細(xì)胞壁生物幾丁質(zhì)合成酶的基因的轉(zhuǎn)錄激活所必需的[13]。有研究顯示：通過dectin-1染色分析了Δr1mA菌絲細(xì)胞壁中的含量，發(fā)現(xiàn)R1mA缺失菌株中幾丁質(zhì)含量增加，細(xì)胞壁酶促水解增強(qiáng)，生物膜形成減少，進(jìn)而可引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重塑[14]。此外，RlmA在無(wú)性分化過程中參與細(xì)胞壁合成和重塑的基因表達(dá),包括flbB、flbC、brlA、abaA和rasB，還可以影響氣生菌絲中幾丁質(zhì)的含量[4]。

α-(1，3)-葡聚糖 在煙曲霉中，α-(1,3)-葡聚糖分別占菌絲體和分生孢子細(xì)胞壁多糖的40%和19%。它是一種主要的黏合劑，參與萌發(fā)的分生孢子的聚集和生物膜的形成[15]。在基因組中發(fā)現(xiàn)了大量能夠修飾α-(1，3)-葡聚糖鏈的α-(1，3)-葡聚糖酶的相關(guān)基因,如AGS[16]。AGS基因的缺失導(dǎo)致分生孢子細(xì)胞壁的廣泛結(jié)構(gòu)修飾，特別是分生孢子表面，疏水小棒狀蛋白被無(wú)定形糖蛋白基質(zhì)覆蓋，會(huì)引起細(xì)胞壁重組[17-18]。

半乳甘露聚糖 半乳甘露聚糖由線性甘露聚糖主鏈和半乳糖呋喃側(cè)鏈組成。DFG家族(包含DGF1/2/3/4/5/7等)是參與細(xì)胞壁重塑的酵母和絲狀真菌共有的4個(gè)GPI錨定蛋白家族之一。它對(duì)于半乳甘露聚糖插入煙曲霉細(xì)胞壁是絕對(duì)必要的，且在細(xì)胞壁適當(dāng)?shù)亩ㄎ粚?duì)于煙曲霉的正確形態(tài)發(fā)生也是必需的。其中DFG3最為重要，在Δdfg3和含有dfg3缺失的多基因缺失突變體中，其細(xì)胞壁中半乳甘露聚糖的含量大大缺失，分生孢子生長(zhǎng)率下降。正是由于它的缺失會(huì)導(dǎo)致半乳甘露聚糖插入細(xì)胞壁的功能缺陷，進(jìn)而有助于分泌蛋白通過細(xì)胞壁釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重塑[19]。

1.2 GPI錨定蛋白

在真菌中，許多GPI錨定蛋白(GPI-AP)參與細(xì)胞壁聚合物的重塑[20]。GPI錨定的蛋白質(zhì)通過高爾基體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，GPI錨作為在分泌和內(nèi)吞途徑中轉(zhuǎn)運(yùn)GPI錨定蛋白質(zhì)的分類信號(hào)，當(dāng)GPI附著到蛋白質(zhì)后，GPI錨的結(jié)構(gòu)被重塑，從而調(diào)節(jié)GPI錨定蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和定位[21]。GPI脂質(zhì)重塑蛋白(稱為PerA)缺失會(huì)影響GPI的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞壁的合成[22]，在PerA缺失菌株中，幾丁質(zhì)和β-葡聚糖含量減少，進(jìn)一步導(dǎo)致其細(xì)胞壁重塑[23]。

2 調(diào)節(jié)細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子

2.1 通過改變細(xì)胞壁多糖成分調(diào)節(jié)細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)

轉(zhuǎn)錄因子SomA與釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子Flo8類似，在煙曲霉細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)有著重大作用。尤其是對(duì)細(xì)胞壁多糖的生物合成有著直接調(diào)節(jié)作用，對(duì)于維持正常的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成也是必需的。研究發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，ΔsomA菌株細(xì)胞壁β-(1,3)-葡聚糖量減少了50%，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁穩(wěn)定性下降。其次，表達(dá)譜和全基因組染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)顯示SomA可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因(如medA、wsc3)的表達(dá)[24]。

2.2 通過調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)酶活性調(diào)節(jié)細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)

在煙曲霉中海藻糖生物合成基因的缺失顯著改變了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和完整性。海藻糖合酶調(diào)節(jié)亞基同源物TslA和TslB：TslA通過與CsmA(幾丁質(zhì)合酶)互相作用來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)合成酶活性，還可以影響CsmA的細(xì)胞定位。在野生型煙曲霉中，CsmA主要定位于生長(zhǎng)中的菌絲頂端和隔膜，相比之下，ΔtslA菌株中CsmA的定位沿著菌絲的一側(cè)細(xì)胞壁和整個(gè)細(xì)胞質(zhì)分散，并且在空間上不限于菌絲尖端或隔膜。TslA的缺失通過改變CsmA的定位導(dǎo)致幾丁質(zhì)合酶活性的失調(diào)，由于幾丁質(zhì)合酶對(duì)細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，所以TslA可能通過影響CsmA的錯(cuò)誤定位導(dǎo)致細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)破壞。其次，TslA還可以通過破壞菌絲細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和β-葡萄糖的平衡、降低分生孢子和菌絲體中海藻糖的含量，引起細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)的改變[25-26]

3 通過定位影響煙曲霉生長(zhǎng)的相關(guān)基因、蛋白

3.1 定位于菌絲頂端隔膜的相關(guān)基因、蛋白

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶：煙曲霉鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化(CnaA)和調(diào)節(jié)(CnaB)亞單位復(fù)合體在隔膜上的正確定位對(duì)于煙曲霉菌絲生長(zhǎng)非常重要[27]。CnaA和CnaB在隔膜處的定位是相互依賴、共同發(fā)揮作用的。其復(fù)合體通常在隔膜形成過程的早期形成，對(duì)隔膜的形成和維持起主要作用。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通過圍繞隔膜孔形成一個(gè)圓盤定位于在菌絲隔膜的兩側(cè)來(lái)調(diào)節(jié)菌絲生長(zhǎng)。其中一些殘基的突變會(huì)導(dǎo)致鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在菌絲隔膜處的錯(cuò)誤定位，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壁缺陷，讓菌絲的生長(zhǎng)與延伸受到影響[28-300]。

3.2 定位于質(zhì)膜的相關(guān)基因、蛋白

Ras蛋白是質(zhì)膜相關(guān)的GTPases，它在質(zhì)膜上的正確定位對(duì)于感染過程中侵入性菌絲的形成至關(guān)重要[31]。在煙曲霉中，產(chǎn)生兩種Ras蛋白:一種與人類HRas高度相似，命名為RasA，另一種命名為RasB，僅由絲狀真菌在質(zhì)膜上產(chǎn)生，煙曲霉菌絲的萌發(fā)和菌態(tài)發(fā)生的協(xié)調(diào)，取決于其在質(zhì)膜上的正確定位。棕櫚?；赗asA定位中起主要作用，棕櫚酰脂質(zhì)部分的存在使RasA-質(zhì)膜結(jié)合的穩(wěn)定性增加了幾倍。但是它的基因序列靶向突變使RasA在質(zhì)膜上錯(cuò)誤定位，導(dǎo)致菌絲形態(tài)、細(xì)胞壁發(fā)生缺陷。在裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中，RasA棕櫚酰化基序敲除后，其定位僅限于內(nèi)膜，在內(nèi)膜中與鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF) Efc25p相互作用，并通過Cdc42介導(dǎo)的途徑發(fā)出信號(hào)以控制細(xì)胞形態(tài)[32-34]。

GPI錨定蛋白：糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白在真核生物中普遍存在，主要存在于富含甾醇和鞘脂的特殊微結(jié)構(gòu)域的質(zhì)膜中[35]。由核心結(jié)構(gòu)組成的GPI前體會(huì)預(yù)先附著在PI上的質(zhì)膜上，且每個(gè)核心甘露糖上帶有一個(gè)EtNP殘基，在GPI錨上添加第二個(gè)甘露糖的EtN-P對(duì)于細(xì)胞壁GPI定位是必需的，但是在GPI錨的第二個(gè)甘露糖殘基上缺乏EtN-P并不影響細(xì)胞壁合成所需的GPI-PMPs(質(zhì)膜GPI錨定蛋白)的定位，但是添加EtN-P對(duì)于GPI-CWPs(細(xì)胞壁GPI錨蛋白)的定位至關(guān)重要[36-37]。

3.3 定位于高爾基體的相關(guān)基因、蛋白

糖基轉(zhuǎn)移酶家族clpA：是一種414個(gè)氨基酸長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，具有高爾基體定位糖基轉(zhuǎn)移酶典型的第二類跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，一種參與莢膜形成和毒性的假定的糖基轉(zhuǎn)移酶。研究發(fā)現(xiàn)，該基因定位于煙曲霉高爾基體。clpA基因的靶向缺失會(huì)導(dǎo)致GPI錨的生物合成，影響它在高爾基體的正確定位，進(jìn)一步造成煙曲霉細(xì)胞壁缺陷、菌絲生長(zhǎng)異常[38]。

4 小 結(jié)

近年來(lái)，免疫抑制劑等藥物在臨床上的廣泛使用，導(dǎo)致機(jī)會(huì)性致病菌煙曲霉感染率不斷上升，由于抗真菌藥物的不規(guī)范使用以及環(huán)境中唑類殺菌劑的暴露，煙曲霉對(duì)抗真菌藥物(尤其為唑類藥物)的耐藥性迅速增加。所以新的抗真菌藥物的發(fā)掘迫在眉睫。目前，細(xì)胞壁作為藥物開發(fā)的理想目標(biāo)，人們對(duì)它的研究在不斷深入，了解其發(fā)病的機(jī)制，特別是細(xì)胞壁的重塑及正確定位尤為重要。