范卓然，顧艷，華紹芳

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特發(fā)疾病，是導(dǎo)致母體、胎兒和新生兒患病率與死亡率增加的重要原因。盡管PE的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但發(fā)生于孕34周前的早發(fā)型子癇前期（early onset preeclampsia，EOPE）與滋養(yǎng)細(xì)胞侵入障礙、胎盤(pán)缺氧關(guān)系密切，并增加胎兒生長(zhǎng)受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）風(fēng)險(xiǎn)[1]。胎盤(pán)是具有轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、防御等多種功能的重要胎兒附屬物，其形成及功能發(fā)揮取決于滋養(yǎng)細(xì)胞正常的增殖、凋亡、分化與侵入過(guò)程[2]。P27基因作為周期蛋白/周期蛋白激酶抑制蛋白（CiP/kiP）家族重要成員參與細(xì)胞周期的正常進(jìn)展[3]?，F(xiàn)就P27基因與PE發(fā)生機(jī)制的相關(guān)性研究進(jìn)行綜述。

1 P27基因與細(xì)胞周期

真核細(xì)胞周期的正常進(jìn)展需要細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）配合cyclin促進(jìn)細(xì)胞增殖，并依靠細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）進(jìn)行調(diào)節(jié)。CKIs常與 Cyclin、CDKs或Cyclin/CDK復(fù)合體結(jié)合阻止CDKs的活動(dòng)，CKIs按其結(jié)構(gòu)與功能分為CDK4抑制劑（Ink4）家族與CiP/kiP家族，P27基因則屬于CiP/kiP家族[4]。P27基因定位于第12號(hào)染色體上，常與Cyclin/CDK結(jié)合阻止細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，CDK2是P27蛋白的主要結(jié)合目標(biāo)，P27基因的表達(dá)在G0和G1早期較豐富，其與CyclinE/CDK2結(jié)合并阻止其活性。在P27蛋白的氨基端有與Cyclin/CDK結(jié)合的激酶抑制結(jié)構(gòu)域，由Cyclin結(jié)合區(qū)和激酶結(jié)合區(qū)組成，P27蛋白通過(guò)激酶結(jié)合區(qū)與CDK2結(jié)合，通過(guò)Cyclin結(jié)合區(qū)與CyclinE相互作用[5]。作為一種抑癌基因，P27阻止細(xì)胞周期進(jìn)展的作用已有報(bào)道，而近年又有研究顯示P27對(duì)細(xì)胞分化、凋亡與遷移也有重要影響，并在一定條件下可能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞增殖的作用[6]。

2 PE患者胎盤(pán)P27表達(dá)

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子可能通過(guò)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與分化而在PE患者胎盤(pán)病理中發(fā)揮重要作用，PE患者胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞存在異常增殖及凋亡增多[7]。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子如何協(xié)調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與分化，影響其增殖與分化的因素有哪些，以及PE患者改變滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制都尚不明確，因此了解細(xì)胞周期因子在病理性胎盤(pán)中的作用尤為重要。

Unek等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠對(duì)照組相比，PE患者胎盤(pán)組織存在更為顯著的鈣化、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)、絨毛間與絨毛內(nèi)纖維素樣沉積等病理改變；在胎盤(pán)基板上，纖維素樣沉積、壞死部位更多見(jiàn)。P27基因在胎盤(pán)絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體細(xì)胞-吞噬細(xì)胞、絨毛間質(zhì)細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜上皮及絨毛膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)、染色強(qiáng)度均明顯增加，在細(xì)胞外滋養(yǎng)細(xì)胞中增加更加明顯。其增加可能與絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入減少有關(guān)，這可能也是PE患者胎盤(pán)早剝發(fā)生率比正常孕婦高3倍的重要原因[9]。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及核抗原Ki-67等增殖標(biāo)志物在PE患者胎盤(pán)中顯著減少，細(xì)胞周期抑制因子P27和P57基因的表達(dá)明顯增加。這一改變可能與侵襲性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加有關(guān)[9]。

3 P27基因參與PE的發(fā)病機(jī)制

3.1 P27蛋白、CDK細(xì)胞質(zhì)易位調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖P27可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)自由穿梭從而發(fā)揮不同作用。正常情況下，G0期P27蛋白只定位于細(xì)胞核內(nèi)并阻止CDK2活性，G1期P27逐漸移至細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞進(jìn)入S期，CyclinE蛋白水平上升，其與CDK2結(jié)合并活化，從而導(dǎo)致P27的T187殘基磷酸化，使P27變得不穩(wěn)定并通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，P27失去CKIs的作用，從而使CDK2和CyclinE/A復(fù)合體恢復(fù)活性并參與DNA復(fù)制的啟動(dòng)，P27在G1期很快被水解，在S期時(shí)已很少能檢測(cè)到[10]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）對(duì)調(diào)節(jié)多種類(lèi)型細(xì)胞的增殖與分化至關(guān)重要，通過(guò)TGF-β的Ⅰ型受體抑制劑抑制TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)P27的不穩(wěn)定性增加，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可促進(jìn)P27的細(xì)胞質(zhì)易位，在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中的P27可能發(fā)揮致癌作用[11]。作為T(mén)GF-β超家族成員，Nodal信號(hào)通路與P27基因的表達(dá)關(guān)系密切。激活素受體樣激酶 7（activin receptor-like kinase，ALK7）是TGF-β的Ⅰ型受體。有研究顯示，Nodal過(guò)表達(dá)或ALK7上調(diào)增加P27 mRNA在滋養(yǎng)細(xì)胞中的水平[12]。另外，轉(zhuǎn)染重組Nodal（rNodal）或ALK7的滋養(yǎng)細(xì)胞P27蛋白水平較未轉(zhuǎn)染組也有增高，且蛋白質(zhì)的存在時(shí)間也較未轉(zhuǎn)染組明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明Nodal影響P27蛋白的穩(wěn)定性[12]。在用編碼Nodal前體（N53）或成熟Nodal（N56）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的滋養(yǎng)細(xì)胞中，P27主要存在于細(xì)胞質(zhì)，而正常滋養(yǎng)細(xì)胞P27幾乎全部限制于細(xì)胞核內(nèi)。P27常與CDK2形成復(fù)合物以阻斷G1/S期進(jìn)程來(lái)阻止細(xì)胞增殖[13]，而Nodal未轉(zhuǎn)染組CDK2檢測(cè)其位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染組則可在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到，說(shuō)明Nodal/ALK7誘導(dǎo)P27和CDK2的細(xì)胞質(zhì)易位，且細(xì)胞質(zhì)中的P27仍保留細(xì)胞周期抑制功能[12]。在rNodal轉(zhuǎn)染組，P27被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，但并沒(méi)有導(dǎo)致S期的進(jìn)展或P27蛋白的降解。相反，rNodal誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有P27的積累，且將細(xì)胞阻滯于G1期，減少細(xì)胞增殖。Nodal有兩型受體，即ALK4和ALK7。TGF激活A(yù)LK5使激活素A（Activin-A）與ALK4結(jié)合，促使轉(zhuǎn)錄激活因子Smad2/3磷酸化[14]。將滋養(yǎng)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Activin-A、rNodal及活性ALK7或 ALK5、ALK4 后發(fā)現(xiàn)，rNodal、TGF-β1、活性 ALK7或ALK5可使P27蛋白和CDK2細(xì)胞質(zhì)易位增加，而Activin-A、ALK4無(wú)此作用，這些結(jié)果表明，P27和CDK2的細(xì)胞質(zhì)易位可能是生長(zhǎng)因子抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移的共同特征[12]。P27的功能主要是通過(guò)翻譯后修飾來(lái)調(diào)節(jié)，如磷酸化，其決定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位，及在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中積累的復(fù)雜過(guò)程[13]。P27基因細(xì)胞核的表達(dá)被證明可調(diào)控細(xì)胞周期，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，P27在細(xì)胞質(zhì)中被磷酸化降解，細(xì)胞質(zhì)中的P27不能發(fā)揮其作為CKIs的功能，而Nodal可增加P27的細(xì)胞質(zhì)易位并保留其功能[15]。

研究顯示P27基因的T198、T157、S10磷酸化可能與引起P27細(xì)胞質(zhì)滯留有關(guān)。P27的核定位序列（nuclear location sequence，NLS）包含 Thr157、Thr178殘基，通過(guò)蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）對(duì)T157、T178殘基的磷酸化導(dǎo)致P27蛋白的細(xì)胞質(zhì)易位，加強(qiáng)P27與14-3-3伴侶蛋白的結(jié)合作用，維持胞質(zhì)中的P27蛋白含量，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期，P27-S10殘基的磷酸化就成為將P27從細(xì)胞核輸出至細(xì)胞質(zhì)的強(qiáng)而活躍的信號(hào)[16]。S10殘基磷酸化后的P27通過(guò)包括CDK5、激酶相關(guān)蛋白等與染色體區(qū)域維持因子 1（chromosome region maintenance factor 1，CRM1）結(jié)合來(lái)刺激P27的核出口[17]。在正常滋養(yǎng)細(xì)胞中，磷酸化P27-S10只局限于細(xì)胞核內(nèi)。向轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染rNodal的滋養(yǎng)細(xì)胞中加入野生型P27（P27WT）、P27非磷酸化突變體（P27-S10A）及P27磷酸化模擬突變體（P27-S10D）后發(fā)現(xiàn)Nodal誘導(dǎo)了P27WT的細(xì)胞質(zhì)易位，而在細(xì)胞質(zhì)中也檢測(cè)到P27-S10D的存在，P27-S10A則主要局限于細(xì)胞核內(nèi)[12]。在未轉(zhuǎn)染rNodal的滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中也檢測(cè)到P27-S10D的存在，由此證明P27在S10殘基的磷酸化是Nodal調(diào)節(jié)其細(xì)胞質(zhì)易位所必需的蛋白修飾[17]。Nodal誘導(dǎo)的P27基因的表達(dá)增加及P27/CDK2的細(xì)胞質(zhì)易位表明P27在Nodal介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯中發(fā)揮重要作用。

另外，P27也是Nodal調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵介質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中的P27與不同蛋白質(zhì)結(jié)合可發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞遷移的作用。如P27與微管不穩(wěn)定蛋白（Stathmin）結(jié)合可阻止細(xì)胞遷移[18]，而與G蛋白超家族成員RhoA結(jié)合則促進(jìn)細(xì)胞遷移[19]。Stathmin是一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，有特有的解聚活性，其高表達(dá)與腫瘤的分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，CDK2/CDK5及磷酸化Stathmin可降低微管不穩(wěn)定活性[20]。P27蛋白在T198位的磷酸化增加了P27的細(xì)胞質(zhì)易位，使P27蛋白與RhoA的結(jié)合能力增強(qiáng)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)Nodal阻滯P27的T198磷酸化，且促進(jìn)P27蛋白與Stathmin相互作用[12]。Nodal可增加 P27與 CDK2、CyclinE、CDK5和Stathmin的關(guān)系及Stathmin在S25和S38的磷酸化，且這種效應(yīng)在CDK2/CDK5抑制劑存在的條件下減弱；Nodal信號(hào)也可能觸發(fā)P27蛋白和CDK2的輸出，導(dǎo)致P27/CDK2/CDK5/Stathmin的結(jié)合，從而使Stathmin過(guò)磷酸化和失活，導(dǎo)致微管蛋白穩(wěn)定，從而減少細(xì)胞遷移和侵襲[12，18]。這些證據(jù)表明Nodal有通過(guò)調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的可能性，其阻滯滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵入的機(jī)制可能與P27不同部位的磷酸化及其與不同蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)。

3.2 調(diào)節(jié)P27蛋白的降解影響細(xì)胞增殖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)P27基因的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。許多細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)（如缺氧、糖基化狀態(tài)改變、鈣離子流異常等）均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這是由一系列的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[21]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，UPR增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（GRP94）及轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）的表達(dá)，UPR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶協(xié)同阻滯了G1期細(xì)胞周期進(jìn)展及蛋白質(zhì)的合成[22]。Han等[22]在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)P27基因在介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的G1期細(xì)胞阻滯中發(fā)揮關(guān)鍵作用。P27蛋白降解需要依賴泛素-蛋白酶體途徑，泛素連接酶復(fù)合體（SCFSKP2）是此降解途徑中使蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，S期激酶相關(guān)蛋白2（SKP2）是P27的特異性E3連接酶，有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)P27的積累是由于抑制其多泛素化和蛋白酶體依賴性降解而產(chǎn)生的，且SCF-SKP2使P27的T198位殘基磷酸化而開(kāi)啟降解過(guò)程[23]。在正常細(xì)胞中，SKP2水平在G0/G1期最低，S期逐漸增多。SKP2的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致P27的減少，與腫瘤的無(wú)限增殖及生存率低有關(guān)[22]。盡管SKP2 有包括 P27、P21、c-myc、E2F1 等在內(nèi)的許多靶點(diǎn)，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間P27是SKP2的特異性靶點(diǎn)[22-23]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt途徑是P27蛋白功能最重要的信號(hào)通路，由幾種重要成分組成，包括受體酪氨酸激酶（RTK）、PI3K、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）和Akt等組成。一些受體，如RTK、整合素、細(xì)胞因子受體和位于細(xì)胞表面（跨膜）的G蛋白耦聯(lián)受體，能夠?qū)⒓?xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，導(dǎo)致PI3K/Akt途徑激活。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)P27基因的表達(dá)有抑制作用，Akt可以直接在T157、T198位殘基上磷酸化P27蛋白，從而阻止P27對(duì)CDK-2（160）的抑制活性[24]。蛋白O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1（proteinO-fucosyltransferase1，poFUT1）通過(guò) PI3K/Akt信號(hào)通路增加了滋養(yǎng)細(xì)胞中CyclinD、CyclinE的表達(dá)，減少P21、P27蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期[25]。磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB1-4）家族在果糖 6-磷酸（F-6-P）磷酸化為果糖－2，6－二磷酸（F-2，6-BP）的糖酵解調(diào)節(jié)中起著重要作用。有研究證實(shí)，PFKFB3也能通過(guò)細(xì)胞核，其產(chǎn)物F-2，6-BP 能激活 CDK1。F-2，6-BP 刺激 T187 處P27蛋白的磷酸化，從而導(dǎo)致P27蛋白泛素化和蛋白酶體降解[26]。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，P27蛋白在腫瘤細(xì)胞中具有腫瘤抑制因子（在細(xì)胞核內(nèi)）和致腫瘤蛋白（在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)）的雙重作用。其功能由P27蛋白的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的易位調(diào)節(jié)。P27基因的表達(dá)通過(guò)與不同因子結(jié)合，影響其翻譯后修飾及亞細(xì)胞定位。而在PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞中，P27在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的作用，P27如何影響胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等能力都有待研究。因此，繼續(xù)揭示P27與PE發(fā)生、進(jìn)展之間的可能相關(guān)性，為預(yù)防PE的發(fā)生，明確其病因、機(jī)制及指導(dǎo)進(jìn)一步治療具有重要意義。