李靜 張欣欣

肝臟疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，已成為人類面臨的公共衛(wèi)生問題之一。目前，肝臟穿刺活檢術(shù)被認(rèn)為是多種肝臟疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，由于受取樣誤差影響，其作為一種侵入性檢查手段具有一定局限性。對于檢測血液標(biāo)志物和多種影像學(xué)檢查等非侵入性方法，雖具較高診療價值，但相對缺乏敏感性和特異性。因此，尋找一種針對肝臟疾病早期、非侵入性的診療方法具有重要意義。

近年來，液體活檢作為“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”無創(chuàng)診療的發(fā)展方向之一，可以通過患者的血液或者其他體液樣本(尿液、胸腔積液等)獲取相關(guān)疾病信息，具有非侵入性、可重復(fù)性、樣本均質(zhì)、樣本抽取方便等優(yōu)點。目前監(jiān)測肝臟疾病的液體活檢指標(biāo)主要有血漿中的細(xì)胞外囊泡、循環(huán)游離DNA、游離非編碼RNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞[1]，常應(yīng)用于疾病的早期診斷、評價轉(zhuǎn)移風(fēng)險、指導(dǎo)研發(fā)新的靶向藥物及制定個體化治療方案等方面。

一、細(xì)胞外囊泡(EVs)

EVs是細(xì)胞釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的膜結(jié)合小泡，根據(jù)直徑和分泌方式的不同分為外泌體和微粒(MPs)。外泌體為直徑30～100 nm的膜性微囊泡，是細(xì)胞膜向內(nèi)突出形成的多囊內(nèi)體，與細(xì)胞膜融合后將外泌體釋放到胞外。MPs是直徑為100～1000 nm的小囊泡，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，細(xì)胞膜通過外排作用釋放MPs到細(xì)胞外。肝臟中的肝細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、匯管區(qū)成纖維細(xì)胞和膽管細(xì)胞均可產(chǎn)生EVs，其攜帶著來源細(xì)胞的特異性蛋白和RNA等生物分子穩(wěn)定存在于體液中，因此EVs表面的標(biāo)記物或其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等成分可以作為液體活檢的新型指標(biāo)。

有研究利用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者、慢性丙型肝炎(CHC)患者和健康志愿者血液中檢測MPs的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比CHC患者和健康人，NAFLD患者單核細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞分泌MPs水平增加，而中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞分泌MPs水平下降。利用類似的表面標(biāo)志物，Rautou等分析了繼發(fā)于CHC和酒精性肝病(ALD)肝硬化患者的血液MPs水平，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的MPs水平高于正常人水平，且隨著Child-Pugh評分的增高而增高。

除了分析EVs表面標(biāo)志物外，還可以分析其攜帶的蛋白質(zhì)和RNA。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)/NAFLD小鼠模型和NASH患者中的EVs均被證實含有特殊的抗原成分。Arbelaiz等分析原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、膽管上皮癌(CCA)、肝細(xì)胞癌(HCC)和正常人4組血液EVs的蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了多種特異性差異蛋白，由此獲得了接近現(xiàn)有腫瘤指標(biāo)的受試者曲線下面積(AUC)。對于EVs攜帶的RNA，尤其是miRNAs，通過分析其濃度及包裝差異逐步成為鑒別診斷的依據(jù)之一。如健康人群肝臟細(xì)胞分泌的miR-122主要與Ago2結(jié)合，在ALD小鼠模型中，肝臟細(xì)胞分泌的miR-122存在于EVs中，在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損害模型中以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，而在NAFLD患者血清中，大多數(shù)的miR-122獨立存在，且隨著時間進展和肝組織的嚴(yán)重程度加重而增多。

二、循環(huán)游離DNA(cfDNA)

cfDNA是一種存在于外周血及體液中的游離DNA，由細(xì)胞凋亡或壞死后釋放產(chǎn)生，平均長度約180個堿基對(bp)。以往研究表明惡性腫瘤患者外周血cfDNA明顯高于健康者，但近期發(fā)現(xiàn)包括自身免疫性疾病在內(nèi)的某種情況下cfDNA也會增高，由此針對cfDNA表觀遺傳學(xué)改變逐漸受到重視，如cfDNA甲基化?，F(xiàn)有研究通過大數(shù)據(jù)分析cfDNA甲基化構(gòu)建出了一種分類器，能夠識別血液樣本中癌癥來源的DNA并確定其屬于哪種癌癥類型[2]。

多個研究表明GSTP1 cfDNA的高甲基化對于診斷肝癌有較高的特異性(70%～91%)和敏感性(50%～75%)。RASSF1A cfDNA的高甲基化與腫瘤的大小正相關(guān)，而LINE-1 cfDNA 的低甲基化代表著腫瘤的進展和預(yù)后較差，把兩者的甲基化狀態(tài)結(jié)合起來可以預(yù)測肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)情況。一項納入1098位HCC患者和835位健康志愿者的研究，成功篩選出了10個cfDNA甲基化的標(biāo)志物用于HCC的靈敏診斷，敏感度和特異度分別為83.3和90.5%，AUC為0.966。通過檢測cfDNA異常甲基化的方法可以比現(xiàn)有HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)提前9年。在肝癌術(shù)后患者尿液中，檢測cfDNA甲基化狀態(tài)可比核磁共振提前9個月監(jiān)測到肝癌復(fù)發(fā)。因此cfDNA甲基化對于腫瘤的早期診斷及預(yù)后評估等有重要作用。但是，對于cfDNA的提取、擴增，甲基化的測定都有較高的要求。此外，作為cfDNA的特殊類型，循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(ctDNA)所攜帶的DNA片段序列可代表整體腫瘤的突變特征，通過測序分析突變情況，可用于不同藥物耐藥機制研究和指導(dǎo)個體化治療。

Hardy等納入了26例經(jīng)肝臟穿刺活檢證實的NAFLD患者，發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA中過氧化酶增殖因子活化受體γ(PPARγ)基因啟動子DNA甲基化水平與肝臟纖維化的程度具有相關(guān)性，因此可以利用血漿PPARγ DNA甲基化的變化來評價NAFLD纖維化的程度，該團隊又進一步在HBV、ALD隊列中進行驗證，證明其高甲基化狀態(tài)特異性地反映肝臟的病理過程。

三、游離非編碼RNA

非編碼RNA分為長鏈非編碼RNA(lncRNA)和短鏈非編碼RNA。lncRNA的長度通常大于200個bp，是非編碼RNA的主要類型。在HCC患者血液中至少有10種lncRNA可供檢測，其中MALAT1和lncSPRY4-1T1隨著肝癌進展而逐漸升高，隨著肝癌術(shù)后而降低。通過監(jiān)測血漿中LINC00152、XLOC014172和RP11-160H22.5水平可以從慢性肝炎、肝硬化患者中早期診斷肝癌，如果聯(lián)合甲胎蛋白(AFP)，AUC可分別達到0.986和0.985。但是由于lncRNA的收集、處理和定量仍有難度，lncRNA在其他肝臟疾病中的作用還未完全確定。

短鏈RNA中，特別是微小RNA(miRNA)已被多個研究證實對于診斷HCC具有潛在應(yīng)用價值，尤其是HCC的早期診斷。以往研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801可以區(qū)分HCC與HBV感染者、肝硬化和健康志愿者。而基于24項miRNA研究的META分析篩選出miR-21、miR-122和miR-199是診斷肝癌最具有特異性的指標(biāo)。一項最新的研究采用了數(shù)字微滴式PCR和RNA測序技術(shù)，證實聯(lián)合血漿中miR-101-3p、miR-106b-3p和miR-1246三者的水平變化對于診斷HCC具有最高的診斷價值。

Zekri等發(fā)現(xiàn)在健康人群中cf-miR-29b、cf-miR-122b、cf-miR-885-5p聯(lián)合AFP可以篩選出早期肝癌(AUC=1)，在肝硬化患者中聯(lián)合cf-miR-22、cf-miR-122、cf-miR-221、cf-miR-885-5p和AFP可篩選出早期肝癌(AUC=0.982)。Okajima等報道，血漿中miR-224的水平與肝癌腫瘤大小相關(guān)，可以利用cf-miR-224的變化檢測到直徑小于18mm的小肝癌。

相比HCC，關(guān)于cf-miRNA在其他肝病的研究正在起步，目前大多數(shù)研究針對HBV和HCV,少數(shù)針對NAFLD和ALD，不同病因之間存在miRNA改變的交叉。有研究指出可以通過cf-miRNA的水平變化來評價疾病的分級，例如，聯(lián)合cf-miR-122水平和血清紫藤凝集素陽性Mac-2結(jié)合蛋白檢測進展期HBV相關(guān)肝纖維化，其敏感率、特異率和準(zhǔn)確率分別為47%、97%和74%。

四、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)

CTCs是指從原發(fā)性腫瘤病灶脫落并侵入外周血循環(huán)的具有高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞，大部分CTCs在機體的作用下發(fā)生凋亡，只有極少部分留存于外周血中，并逐步進行癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Zhang等利用微流體芯片技術(shù)從36位HCC患者中捕獲并3D培養(yǎng)CTCs，用于探索個體對于索拉菲尼和奧沙利鉑的敏感性。通過腫瘤特異性抗原與相應(yīng)抗體磁珠結(jié)合的方法，可將CTCs從血漿中捕獲并計數(shù)，此種方法已在乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌中得到應(yīng)用。雖然通過此方法篩選出的CTCs特異性高，但是其依賴于腫瘤表面的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)，而僅有1/3的肝癌患者EpCAM表達陽性，因此也可能導(dǎo)致假陰性。

有些學(xué)者提出增加肝癌特異性表達的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)作為多分子聯(lián)合標(biāo)記提高HCC診斷的特異度和敏感度。Zhou等發(fā)現(xiàn)EpCAM (mRNA+)CTCs的升高聯(lián)合循環(huán)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的升高預(yù)示著預(yù)后較差且容易復(fù)發(fā)。新一代的微流體芯片技術(shù)CTC-iChip 不依賴于EpCAM對細(xì)胞的選擇，具有更高的捕獲CTC的能力，且能夠進行包括單個細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)的各種分子層面的研究[3]，但目前尚未報道應(yīng)用于HCC。

肝癌細(xì)胞要實現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)的侵襲播散，必須發(fā)生細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞血循環(huán)侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟。Sun等分析比較了肝癌患者外周靜脈血、動脈血、肝下腔靜脈、門靜脈和肝靜脈CTCs的上皮和間質(zhì)表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝靜脈中的CTCs數(shù)量最多，不同類型血管之間CTC的EMT狀態(tài)存在異質(zhì)性，其中大部分CTCs上皮型在經(jīng)過肝靜脈時成為間質(zhì)型獲得擴散轉(zhuǎn)移的能力進入血液循環(huán)。隨訪研究表明在肝靜脈和外周靜脈血中檢測到CTCs和循環(huán)腫瘤栓子分別預(yù)示著HCC術(shù)后肺轉(zhuǎn)移和肝內(nèi)復(fù)發(fā)。相較于檢測CTCs數(shù)量的花費較高而無法推廣使用，分析CTCs 表型特征具有較高的臨床實用性。

另外，CTCs的單細(xì)胞極性是腫瘤細(xì)胞的固有特征，影響著細(xì)胞黏附、遷徙和轉(zhuǎn)移的過程，因此調(diào)控CTCs的單細(xì)胞極性可成為潛在的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)Talin1的表達有助于CTCs黏附于肝臟內(nèi)皮細(xì)胞并加快轉(zhuǎn)移速度，通過抑制Talin1的表達也可能成為新的治療靶點。

綜上所述，液體活檢作為無創(chuàng)的檢測手段，血漿中的EVs、cfDNA、游離非編碼RNA和CTCs可實時動態(tài)監(jiān)測患者的病程，為臨床肝臟疾病，特別是HCC的診斷、疾病分期、療效評價、預(yù)測預(yù)后、耐藥檢測及個體化診療提供了新的途徑。但液體活檢由于技術(shù)成本高，再加上缺乏統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)，真正用于臨床還有較長的路要走。隨著檢測技術(shù)的提升，檢測速度的加快，液體活檢技術(shù)可以加速向臨床發(fā)展，架起通向精準(zhǔn)醫(yī)療的橋梁。