張海芬，高云濤，*，那吉，馬嬌，熊華斌

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南昆明650106；3.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，云南大理617200）

人類很多疾病以及衰老都與體內(nèi)自由基氧化損傷有關(guān)[1-2]，從天然產(chǎn)物中尋找抗氧化活性物質(zhì)是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)[3-5]。水生蔬菜不僅為人類提供所需的糖、維生素、礦物質(zhì)和纖維素，而且還含有豐富的天然抗氧化劑。因此，水生蔬菜為防治人類一些與自由基損傷有關(guān)的疾病提供良好的藥物來(lái)源，并且在抗衰老過(guò)程中起著十分重要的作用[6]。

水生蔬菜（aquatic vegetable）是生長(zhǎng)在淡水中，可供食用和藥用的維管束草本植物[7]，多具有清火、降燥、清熱解毒、降血壓和降血脂等作用[8-25]。中醫(yī)學(xué)研究表明，蓮藕生食清火[16]；茭瓜利大小便、止熱??；荸薺降火、補(bǔ)肺涼肝；慈姑清熱解毒、止咳；水芹菜清熱解毒、利水等。隨著人們養(yǎng)生意識(shí)的增強(qiáng)，藥食同源的水生蔬菜逐漸受到人們的重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，水生蔬菜具有一定的保健和藥用功能。如茭瓜可以開胃、預(yù)防高血壓和動(dòng)脈硬化等[19]；荸薺有抗腫瘤、抗菌、清肺化痰等作用[24]；水芹菜具有降血壓、抗糖尿病、減肥、防止腸癌、防止便秘、抗肝炎、抗疲勞等作用[10-12]。此外，食物的清熱解毒作用與其具有的自由清除活性密切相關(guān)。迄今有關(guān)水生蔬菜的總抗氧化能力研究不夠深入，蓮藕相關(guān)研究較多，其余水生蔬菜并沒有受到廣泛重視[25]。郝轉(zhuǎn)等[26]研究發(fā)現(xiàn)，蓮藕多酚提取物能提高機(jī)體自由基抗氧化損傷的能力，減輕肝脾細(xì)胞DNA損傷程度，從而達(dá)到延緩衰老的目的；周瑋婧等[27]對(duì)蓮藕節(jié)的多酚物質(zhì)和抗氧化性能進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性隨著多酚含量增加而增加，且純化物的活性高于粗提物。另外，對(duì)于荸薺皮的抗氧化活性也有相關(guān)研究。李婕姝等[28]研究發(fā)現(xiàn)，荸薺皮多糖具有清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其清除能力與多糖濃度呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。為促進(jìn)人們對(duì)水生蔬菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的了解，開展對(duì)水生蔬菜抗氧化活性研究具有重要意義。但目前有關(guān)水生蔬菜的抗氧化活性研究報(bào)道較少。

傳統(tǒng)自由基清除試驗(yàn)多采用人工合成DPPH自由基清除法，清除法以測(cè)定抗氧劑對(duì)DPPH自由基517nm吸光度降低為基礎(chǔ)，蔬菜通常含有大量的色素（如葉綠素、花青素在420nm～660nm間有最大吸收波長(zhǎng)[29-30]），其光譜吸收對(duì)DPPH自由基517 nm吸收峰可能存在明顯的光譜干擾，且DPPH自由基具有脂溶性，其測(cè)量體系是乙醇，并不適于日常飲食中攝入等自由基清除能力評(píng)價(jià)。水溶性自由基ABTS+[2，2-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽]是一種總抗氧化能力檢測(cè)試劑，其主要吸收峰位于734 nm，不易受到水生蔬菜提取物的光譜干擾，且操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性好、精密度高[31-33]。本文采用水溶性ABTS法對(duì)常見的8種水生蔬菜水提取物的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，水提取物可以更好模擬日常飲食對(duì)水生蔬菜的攝入，且相對(duì)于DPPH自由基，更好排除光譜干擾問題，旨在為水生蔬菜抗氧化活性研究提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水芋、茭瓜、水蕨菜、荸薺、水芹菜、海菜、蓮藕、慈姑共8種水生蔬菜，樣品信息見表1；ABTS、DPPH：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蒸餾水：云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為分析純。

UV-6000 PC紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PY-101研磨機(jī)、SJIA-2012超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司；SG1200HE超聲清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司；FA 2004電子分析天平：上海上平儀器公司；XZ-6G低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ABTS和DPPH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

根據(jù)文獻(xiàn)[34-36]，配制7.4 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液和2.6 mmol/L的K2S2O8儲(chǔ)備液，分別取2 mL在室溫條件下混合避光保存12 h～16 h，試驗(yàn)時(shí)用pH值為4.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，使其吸光度值為0.7±0.02（λ=734 nm），即得到ABTS工作液；將1 mg/mL的DPPH無(wú)水乙醇溶液，用無(wú)水乙醇稀釋獲得吸光度值為 0.7±0.02（λ=517 nm）的 DPPH 溶液，即得到 DPPH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。以上試劑均在4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蔬菜的預(yù)處理

分別取200 g新鮮的水芋（去皮）、茭瓜、水蕨菜、荸薺、水芹菜、海菜、蓮藕、慈姑可食用部分洗凈，再用蒸餾水涮洗3次瀝干，然后用研磨機(jī)研細(xì)，裝入自封袋密封備用。

1.2.3 蔬菜水提取液的制備

準(zhǔn)確稱取2份5.0 g預(yù)處理過(guò)的樣品于50 mL小燒杯中，加入20 mL蒸餾水，一份在室溫下放入超聲清洗器中超聲浸提90 min，另一份在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中提取20 min，分別將兩份殘?jiān)鸵后w全部轉(zhuǎn)移到離心管中以4 000 r/min的速度離心5 min，取全部上清液進(jìn)行二次離心，收集全部上清液備用。

1.2.4 反應(yīng)波長(zhǎng)的確定

分別測(cè)ABTS、DPPH和樣品溶液的紫外可見吸收曲線，得到其特征吸收峰，再將樣品加入到ABTS溶液中，觀察其特征吸收峰的變化，確定反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.5 反應(yīng)時(shí)間的確定

在ABTS溶液中分別加入樣品溶液，空白不加樣品溶液，對(duì)比一定時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6 ABTS+自由基清除試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[37]的測(cè)定方法，并做如下修改：準(zhǔn)確移取2.0 mL ABTS溶液，分別加入10 μL不同樣品溶液，空白管用蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照管用緩沖溶液代替ABTS工作液，室溫避光放置8 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定其吸光度，并進(jìn)行紫外可見光譜掃描。每份樣品平行操作3次，計(jì)算清除率并比較其清除率的大小，清除率按下式計(jì)算：

式中：Ai為加入2.0 mL ABTS溶液與10 μL樣品溶液反應(yīng)的吸光度；Aj為2.0 mL緩沖溶液與10 μL樣品溶液反應(yīng)的吸光度；A0為2.0 mL ABTS溶液與10 μL蒸餾水反應(yīng)的吸光度。

1.2.7 半數(shù)抑制率（IC50）的計(jì)算

參照1.2.6步驟，并做如下修改：在ABTS溶液中分別加入10 μL不同濃度的樣品溶液，其余均不變，計(jì)算不同濃度樣品溶液對(duì)ABTS+自由基的清除率。以樣品的濃度對(duì)ABTS+自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，計(jì)算IC50值（IC50的定義是清除率為50%時(shí)所需要抗氧化劑的濃度，此抗氧化劑濃度是相當(dāng)于物料的質(zhì)量濃度）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行相關(guān)曲線擬合，得出線性方程及相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步得到半數(shù)抑制濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

為更好模擬人類日常飲食對(duì)水生蔬菜的攝入，選擇蒸餾水作為溶劑，利用超聲和超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)兩種方式進(jìn)行提取，并比較其提取物清除ABTS+自由基的能力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取方法提取的樣品對(duì)ABTS+自由基清除率Fig.1 ABTS+free radical scavenging capacity of extraction samples from different extraction methods

由圖1可知，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取的明顯比超聲提取的清除自由基能力強(qiáng)，其中只有慈姑用兩種方法提取的提取液清除ABTS+自由基能力幾乎相等。為了更好研究不同水生蔬菜的總抗氧化能力，本文選用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行提取。

2.2 樣品溶液清除自由基的紫外可見吸收光譜研究

對(duì)ABTS+、DPPH自由基溶液和樣品溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜掃描，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同溶液的UV-Vis吸收光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectra of different solution

ABTS+自由基溶液（圖 2a）在 225、346、415、734 nm處出現(xiàn)4個(gè)較強(qiáng)的特征吸收峰，DPPH自由基溶液（圖2b）在328 nm和517 nm處出現(xiàn)兩個(gè)較強(qiáng)的特征吸收峰，樣品溶液的紫外-可見吸收光譜如圖2c所示，在200 nm～500 nm之間存在許多雜峰，這些峰與ABTS+在225、346、415nm處和DPPH 328 nm處的吸收峰存在一定的干擾作用，導(dǎo)致吸光度值增大，樣品清除率出現(xiàn)負(fù)偏差；樣品溶液在波長(zhǎng)500 nm～600 nm之間隨著波長(zhǎng)的不斷增加吸光度值不斷減小，并且波長(zhǎng)靠近500 nm吸光度變化特別快，因此會(huì)對(duì)DPPH 517 nm處的特征吸收峰產(chǎn)生一定的干擾，而在650 nm～700 nm之間水芹菜有一個(gè)吸收峰，但波長(zhǎng)大于700 nm部分，樣品溶液無(wú)吸收峰并且吸光度隨波長(zhǎng)變化特別小可忽略，因此不會(huì)對(duì)ABTS在734 nm處的吸收峰產(chǎn)生疊加作用，也不會(huì)產(chǎn)生干擾。再將樣品溶液加入到ABTS+自由基溶液中，進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖2d所示。由圖2d可知，加入樣品溶液后ABTS+自由基溶液225、346 nm處的吸收峰形都有所變化，而415 nm和734 nm處的峰形沒有明顯變化。但是415 nm附近樣品溶液吸光度值變化比較明顯，也會(huì)存在波譜干擾現(xiàn)象。綜上所述，本試驗(yàn)宜選擇ABTS+自由基溶液進(jìn)行自由基清除試驗(yàn)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

反應(yīng)體系能否達(dá)到穩(wěn)定對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響尤為重要，它直接關(guān)系到測(cè)量結(jié)果。本文研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)不同抗氧化劑與ABTS+自由基反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溶液吸光度值隨時(shí)間增加的變化圖Fig.3 The variation of solution absorbance value as the time gone

ABTS+自由基與不同抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間會(huì)存在一定的差異，但達(dá)到一定時(shí)間后反應(yīng)基本達(dá)到平衡。在ABTS+中加入相同濃度的不同抗氧化劑后，ABTS在734 nm處的特征吸收峰值迅速下降，8 min后基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明開始反應(yīng)至8 min這段時(shí)間，抗氧化劑清除ABTS+自由基反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)速率較快，但反應(yīng)8 min后基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)速率很慢，對(duì)結(jié)果的影響也較?。珊雎裕Ｒ虼?，本文選擇8 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.4 樣品溶液對(duì)ABTS+自由基的清除活性

通過(guò)以上試驗(yàn)，在通過(guò)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取樣品溶液，反應(yīng)波長(zhǎng)734 nm、反應(yīng)時(shí)間8 min的條件下，測(cè)定同一濃度下不同樣品的清除率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 同一濃度的8種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.4 Scarseaging capacity of eight estracts of the same extract to ABTS+radical

水生蔬菜的抗氧化能力差別很大，其中抗氧化能力最強(qiáng)的是水蕨菜，最弱的是茭瓜。從圖4中可知8種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力依次為：水蕨菜＞蓮藕＞水芋＞水芹菜＞荸薺＞海菜＞慈姑＞茭瓜。但是單一濃度下測(cè)定的抗氧化活性具有一定的局限性，不能代表所有濃度下的抗氧化活性。為更好的評(píng)價(jià)其抗氧化活性。本試驗(yàn)采用梯度濃度的水生蔬菜提取物清除ABTS+自由基，測(cè)定其抗氧化活性，得到清除率如圖5和圖6所示。

圖5 3種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scarseaging capacity of three concentration to ABTS+radical

圖6 5種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scarseaging capacity of five estract to ABTS+radical

8種提取物均對(duì)ABTS+自由基具有清除作用，從整體看，隨著提取物濃度的不斷增加清除作用不斷增強(qiáng)，說(shuō)明8種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力存在一定的量效關(guān)系，根據(jù)量效關(guān)系進(jìn)行線性擬合得到線性方程和相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0），進(jìn)而得到IC50值，結(jié)果如圖7所示。

圖7 清除ABTS+自由基的IC50值Fig.7 The IC50of ABTS+scarseaging rate

8種提取物清除ABTS+自由基的IC50值分別為：海菜2.412mg/mL、水芹菜1.795mg/mL、慈姑2.932mg/mL、蓮藕0.974mg/mL、荸薺2.517mg/mL、水蕨菜0.140mg/mL、茭瓜4.111 mg/mL、水芋1.594 mg/mL（此濃度是相當(dāng)于物料的質(zhì)量濃度）。IC50值越高說(shuō)明其抗氧化能力越弱，因此抗氧化能力由弱到強(qiáng)依次為茭瓜、慈姑、荸薺、海菜、水芹菜、水芋、蓮藕、水蕨菜。水蕨菜的半數(shù)抑制濃度（0.140 mg/mL）明顯低于其他幾種蔬菜，通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知水蕨菜中含有豐富的胡蘿卜素、維生素C、氨基酸等[38]，胡蘿卜素和維生素C都是強(qiáng)抗氧化劑，導(dǎo)致水蕨菜的抗氧化能力很強(qiáng)。此外，胡蘿卜素、維生素與酚類之間存在相互協(xié)同作用也可使水蕨菜有較強(qiáng)的抗氧化活性[39]；而茭瓜的半數(shù)抑制濃度較高，其中茭瓜中主要以碳水化合物和粗纖維為主，維生素含量較低[19]，含抗氧化劑的種類和含量相對(duì)其它幾種水生蔬菜較少，因此清除自由基能力相對(duì)較弱；水芋中也含有維生素和碳水化合物，但抗氧化能力明顯強(qiáng)于茭白，說(shuō)明水芋中的維生素、碳水化合物的種類和含量有一定差異或者水芋中還含有其它抗氧化物質(zhì)；水芹菜中主要以黃酮為主[11-12]，抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)；荸薺中也含有黃酮，并且還含有維生素、多糖、多酚等[24]，但抗氧化能力比水芹菜弱，說(shuō)明荸薺中抗氧化物質(zhì)的含量偏低；海菜中主要含有礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、鈣和磷等[40]，其抗氧化能力相對(duì)較好。慈姑則以慈姑多糖抗氧化為主。

3 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明ABTS+自由基在734 nm處水生蔬菜提取物對(duì)ABTS+自由基反應(yīng)不產(chǎn)生光譜干擾，避免了DPPH自由基517 nm易于產(chǎn)生光譜干擾問題。且ABTS+自由基具有親水性，更適于模擬人體日常飲食對(duì)水生蔬菜的攝入等的自由基清除能力評(píng)價(jià)。根據(jù)ABTS+自由基清除試驗(yàn)得到這8種水生蔬菜的半數(shù)抑制濃度IC50值依次為茭瓜（4.111 mg/mL）＞慈姑（2.932mg/mL）＞荸薺（2.517mg/mL）＞海菜（2.413mg/mL）＞水芹菜（1.795 mg/mL）＞水芋（1.594 mg/mL）＞蓮藕（0.974 mg/mL）＞水蕨菜（0.140 mg/mL），8種水生蔬菜均具有良好的抗氧化活性，能快速、有效的清除自由基，其中水蕨菜的抗氧化能力最強(qiáng)。由于水生蔬菜中成分復(fù)雜多樣，其抗氧化活性表現(xiàn)出一定差異，此外，含量對(duì)抗氧化活性也有很大影響，需對(duì)水生蔬菜中主要成分進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，才能得到比較科學(xué)合理的結(jié)論。