申　敏

油菜單倍體遺傳轉(zhuǎn)化的條件

申敏

（長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院山西長治046000）

小孢子作為一種單倍體材料可以進(jìn)行外源基因遺傳轉(zhuǎn)化，這種方式可以加快轉(zhuǎn)基因材料純合速度，在染色體加倍后，導(dǎo)入的外源性狀能以純合體的形式體現(xiàn)。排除了隱性干擾，提高了選擇的準(zhǔn)確性。文章從單倍體概念及原理、轉(zhuǎn)化的主要技術(shù)環(huán)節(jié)及其特點(diǎn)、后代鑒定等進(jìn)行了分析。

單倍體；遺傳轉(zhuǎn)化；進(jìn)展

油菜是一種重要的油料作物，現(xiàn)階段大部分研究進(jìn)行轉(zhuǎn)化的材料大都是二倍體的組織，得到的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)常是雜合體[1]，在后代培養(yǎng)中容易造成外源基因的丟失，限制了在基因改良中的優(yōu)勢利用。

小孢子或是小孢子衍生胚、花粉和小孢子培育體系在多種有重要商業(yè)價(jià)值的高等植物中已經(jīng)有過報(bào)道。依據(jù)小孢子本身的特性可以使得小孢子作為基因純合的優(yōu)良受體。在染色體加倍后，導(dǎo)入的外源性狀能以純合體的形式體現(xiàn)。這種方法還可以用來在經(jīng)過了胚胎的基因轉(zhuǎn)移和突變重新得到單個(gè)植株的同質(zhì)植株。單倍體最關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因會使轉(zhuǎn)化株馬上表達(dá)轉(zhuǎn)化性狀，簡化了遺傳分析，增加基因劑量。單倍體轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于雜交后純系品種快速繁殖。

1 油菜單倍體轉(zhuǎn)化的外植體

小孢子衍生的胚、單倍體莖段、莖節(jié)間、莖段、葉柄、子葉下胚軸、原生質(zhì)體和小孢子等各種外植體可以用在遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

小孢子再生能力非常強(qiáng)，后期更易獲得需的材料。剛分離的小孢子作為轉(zhuǎn)化受體選擇主花序或第一次分枝花序3～4 mm的花蕾，在油菜花藥培養(yǎng)中，只有單核晚期的小孢子可能發(fā)育成胚狀體。在開花四天摘取3～4 mm的花蕾時(shí)，小孢子的發(fā)育一致性較好[2]。

對于甘藍(lán)型油菜，從器官、組織、細(xì)胞三個(gè)水平研究了供體植株不同外植體部位再生情況及影響再生反應(yīng)的一些因素，并對甘藍(lán)型油菜小孢子來源的再生組培苗進(jìn)行了倍性水平的鑒定[2]，結(jié)果表明，利用莖段節(jié)間再生腋芽是一種較好的快速再生植株方式，具有出芽快，遺傳特性保持好的特點(diǎn)，莖段具有較強(qiáng)的分化芽能力，而葉柄和葉片難以誘導(dǎo)芽分化。

2 油菜單倍體轉(zhuǎn)化的主要技術(shù)環(huán)節(jié)

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中LBA4404 ，EHA101 已經(jīng)成功獲得油菜轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在植物轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用較為廣泛：將所需接種的工程菌接種在YEB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)28 度震蕩過夜，培養(yǎng)至對數(shù)期離心收集菌體，然后將液體培養(yǎng)基洗滌幾次，再用NLN培養(yǎng)基重懸備用。

小孢子進(jìn)行32 度熱激處理使用農(nóng)桿菌工程菌株侵染進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，離心（2 000 r/min，3 min）收集共培養(yǎng)后的小孢子，將處理后的小孢子用新鮮的含100 mg/L的羧芐青霉素培養(yǎng)基暗培養(yǎng)直至小孢子長出肉眼可見的小胚狀體，再將小孢子移接到篩選壓（Kan 50 mg/L）的培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生[3]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最廣泛，適用范圍最廣的一種轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在油菜轉(zhuǎn)化中效率也很高[3]。

2.2 基因槍轉(zhuǎn)化或微粒轟擊法

使用PDS-1000 型高壓基因槍轟擊小孢子，根據(jù)預(yù)定參數(shù)參照說明書操作，金粉使用量為130 ul金粉，DNA使用量為0.7 ug。轟擊以后暗處理16 h，再逐漸轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中。小孢子采用熱激處理可以產(chǎn)生較高的胚狀體分化率。

微粒轟擊優(yōu)點(diǎn)是：適用范圍廣，精確和實(shí)用。但是這個(gè)方法在油菜中并沒有很普及，因?yàn)檗r(nóng)桿菌接到法在油菜轉(zhuǎn)化中效率同樣很高[4]。缺點(diǎn)是：高速粒子進(jìn)入細(xì)胞后會破壞細(xì)胞膜引起細(xì)胞損傷而且會導(dǎo)致乙烯積累。0.4 M甘露醇可以解決這個(gè)問題，濃度太高（0.5 M）會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。較低的粒子轟擊壓力會得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。

2.3 影響小孢子與小孢子衍生胚再生的因素

小孢子預(yù)處理?xiàng)l件

（1）低溫處理及處理時(shí)間：小孢子在與工程菌株共培養(yǎng)之前先低溫處理刺激小孢子生長。

對供體材料小孢子進(jìn)行低溫預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)小孢子胚胎再生能力顯著提高，而不同的基因型預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)低溫處理時(shí)間越長小孢子的胚發(fā)育能力下降，表示低溫處理影響小孢子的胚發(fā)育下降，胚胎發(fā)生率提高。

（2）消毒時(shí)間與濃度：在7 %的次氯酸鈉溶液中表面消毒15 min，次氯酸鈉濃度過高則花蕾脫水失去活性，濃度偏低則易污染。

（3）小孢子培養(yǎng)密度：在NLN13 液體培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)時(shí)，小孢子最佳密度是（Φ60 mm*15 mm培養(yǎng)皿）是兩個(gè)花蕾提取的小孢子，在加入多菌靈和鏈霉素的MS培養(yǎng)基，可提高成苗率，使用滅菌水處理沖洗，沖洗后再用少量培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗。培養(yǎng)基均用0.22 um濾膜過濾滅菌。用玻璃棒將花蕾研碎。尼龍網(wǎng)過濾，離心后沉淀小孢子。

（4）小孢子培養(yǎng)時(shí)間：小孢子培養(yǎng)三天作為轉(zhuǎn)化受體比剛分化的小孢子作為受體進(jìn)行誘變處理，培養(yǎng)三天的小孢子轉(zhuǎn)化率明顯增加，可能是培養(yǎng)三天后的小孢子已經(jīng)向胚狀體發(fā)育轉(zhuǎn)化。其它培養(yǎng)條件比如說溫度[5]，蔗糖濃度不同等條件的變化對小孢子轉(zhuǎn)化率影響較小。

培養(yǎng)溫度在25 ℃ (白天/晚上) 和16 h光周期。

3 單倍體遺傳研究存在的不足

采用單倍體育種最大的問題是受花期限制，和外源的化學(xué)物質(zhì)處理，例如秋水仙素用來將單倍體植株染色體加倍。通過單倍體育種得到雙單倍體這種技術(shù)并不是適用于任何物種，在有些不適用于單倍體育種技術(shù)的育種物種中，發(fā)展和啟動(dòng)這種技術(shù)成本太大。

小孢子雖然使得轉(zhuǎn)化后容易獲得純合的轉(zhuǎn)基因材料，極大縮短育種時(shí)間等顯著優(yōu)點(diǎn)，但是小孢子自身的缺陷在于：（1）小孢子本身壁較厚，工程菌種侵染轉(zhuǎn)入較為困難，所以需要更多優(yōu)化措施幫助提高轉(zhuǎn)化效率；（2）小孢子受限于物種不同，開花季節(jié)取得小孢子時(shí)間受限，并且小孢子對外界條件比如遺傳因素、抗生素等因素敏感；（3）小孢子衍生胚屬于多細(xì)胞組織，轉(zhuǎn)化這些組織會產(chǎn)生嵌合體。所以高效率的小孢子轉(zhuǎn)化還需要更多深入研究。

[1]杜志釗,陸瑞菊,黃劍華.以單倍體材料為轉(zhuǎn)化受體的植物轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2010(2):302-306.

[2]林良斌,劉雅婷,董娜,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜大田植株小孢子[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006(05):12-17.

[3]陸瑞菊,孫月芳,王亦菲,等. Studies on Improving Response of Microspore Culture in Barley%提高大麥游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的研究[J].大麥與谷類科學(xué),2004,000(002):14-16.

[4]于曉玲,崔百明,衛(wèi)海濱,等.基因槍轉(zhuǎn)化法在棉纖維細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)外源基因的研究%Study on Transient Expression of Target Gene in the Epidermal Cells of Cotton Ovules via Particle Bombardment[J].棉花學(xué)報(bào),2007,019(006):419-423.

[5]王煒,楊隨莊. The Initiation of Microspore Embryogenesis in Higher Plants%高等植物小孢子胚發(fā)生的啟動(dòng)[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,000(001):14-20.

申敏（1987- ），女，山西潞城人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

S513

A

2095-1205(2019)11-27-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.14